Examinando Assembleia proteosoma com recombinante Archaea proteasomas e não desnaturante PAGE: The Case for uma abordagem combinada

Complexos multiprotein realizar inúmeras actividades celulares críticas ^1. Para muitos desses complexos, muito mais se sabe sobre sua estrutura e função do que cerca sua montagem ^2,3. O proteassoma é um tal complexo e é encontrado em todos os domínios da vida. Em eucariotas, esta máquina molecular está no cerne do Sistema Proteasoma / ubiquitina (UPS) e fornece a principal via de degradação da proteína intracelular ^4. O proteassoma eucariótica (referido como o proteassoma 26S) é composto de duas principais subconjuntos: um proteassoma 20S, ou partícula central (CP) ^5, que pode ser tapado com uma ou ambas as extremidades por uma partícula de regulamentação 19S (RP) ^6.

O proteassoma 20S é um grande protease compartimentada. A sua estrutura quaternária é absolutamente conservado em todos os domínios de vida e consiste de uma pilha de quatro anéis de sete membros contendo dois tipos de subunidades estruturalmente relacionadas, α; e p ^5,7,8. Nos eucariotas, os dois anéis exteriores são cada um composto por sete sub-unidades a distintas, e os dois anéis interiores são cada um composto por sete subunidades p diferentes; actividade proteolítica reside dentro de três das subunidades p. Em contraste, os anéis de CP arquebactérias e bactérias são geralmente composta por apenas um tipo de α e um tipo de subunidade β. Proteasomas Arqueais forneceram um importante sistema modelo para estudar a montagem do proteassoma devido tanto à sua simplicidade de composição e sua partilha de um mecanismo de montagem comum com os seus homólogos eucarióticos ^9-13. Em breve, subunidades a montar em anéis alfa em primeiro lugar, que servem como um andaime sobre o qual p subunidades montar. As meias-proteassomas resultantes ₍₇ α β ₇₎ dimerizar, dando origem a CP totalmente montado (α β _{7 7 7} β α _7). Durante a dimerização, os pró-péptidos apresentar em subunidades psão autocataliticamente removida, expondo as treoninas N-terminais catalíticas. A utilização de proteossomas de arqueia para modelar montagem frequentemente leva vantagem de a produção de proteínas recombinantes de proteassoma de arqueia em Escherichia coli. Esta é uma abordagem útil porque permite que as subunidades a ser produzidos em várias combinações, como tanto a WT e versões mutantes, num organismo hospedeiro que não produz as suas próprias proteossomas.

Acompanhamento do conjunto de complexos multi-protéicos requer bioquimicamente algum tipo de método de fraccionamento que separa complexos totalmente montados a partir de intermediários de montagem e precursores. Devido à sua capacidade de resolução superior, não desnaturante em gel de poliacrilamida de electroforese (PAGE), tem provado ser especialmente úteis no fraccionamento de vários grandes complexos multiproteicos ^14-17. A combinação de produção proteassoma archaeal recombinante e PAGE não desnaturante tornou-se uma abordagem poderosa em dissecting de montagem do proteassoma ^9,11,12,18. No entanto, o método usual, através da qual esta abordagem é aplicada (isto é. Por meio da co-expressão recombinante de subunidades a e p) tem uma importante desvantagem. Reações de montagem são cooperativos e fortemente dependente da concentração ^3. Dado que a concentração de proteínas no interior das células é muito alta ^19, devido a efeitos de volume excluído, reacções de montagem proceder rapidamente in vivo. Por isso, é possível perder importantes intermediários de montagem quando aep subunidades são co-expressos.

Aqui, defendem uma abordagem combinada no estudo da montagem do proteassoma usando subunidades de proteassoma archaeal recombinantes. Nesta abordagem, ambos os métodos de mistura e co-expressão de lisado são empregues. O ex-permite a análise rápida de reunião, porque a co-expressão é menos trabalhosa. Este último depende da expressão separada de subunidades a e p, seguidos por mistura. Embora este requires um pouco mais esforço do que co-expressão, é mais do que compensada pela capacidade de detectar intermediários que são perdidas durante a co-expressão. Juntos, estes dois métodos podem fornecer um quadro mais completo de montagem do proteassoma.