Het onderzoeken van Proteasome Montage met Recombinant Archaea Proteasomen en denaturerende PAGE: The Case voor een gecombineerde aanpak

Multiproteïnecomplexen uit te voeren tal van kritische cellulaire activiteiten ^1. Voor veel van deze complexen, meer bekend over hun structuur en functie dan ongeveer ^2,3 de montage. Het proteasoom is zo'n complex en wordt in alle domeinen van het leven. In eukaryoten, deze moleculaire machine is de kern van het ubiquitine / Proteasome System (UPS) en geeft de belangrijkste route van intracellulaire eiwitafbraak ^4. De eukaryote proteasoom (aangeduid als 26S proteasoom) bestaat uit twee belangrijke subassemblages: a 20S proteasoom of kerndeeltje (CP) ^5, die kunnen worden afgesloten aan één of beide einden door een 19S Regulatory Particle (RP) ^6.

Het 20S proteasoom is een groot gecompartimenteerd protease. De quaternaire structuur absoluut geconserveerd in alle levensdomeinen en bestaat uit een stapel van vier zevenringen die twee soorten structureel verwante subeenheden, α; en P ^5,7,8. In eukaryoten worden de twee buitenringen elk bestaande uit zeven verschillende α subeenheden en twee binnenringen elk bestaan ​​uit zeven verschillende β subeenheden; proteolytische activiteit berust bij drie van de β subeenheden. Daarentegen worden de CP ringen archaea en bacteriën gewoonlijk samengesteld uit slechts één type α en één type β subunit. Archaea proteasomen hebben verstrekt een belangrijk model systeem om proteasoom assemblage studeren als gevolg van zowel hun compositorische eenvoud en het delen van een gemeenschappelijke vergadering mechanisme met hun eukaryote tegenhangers ^9-13. Kortom, α subeenheden assembleren in α ringen eerste, die dienen als een stellage waarop ß-subeenheden assembleren. De resulterende half-proteasomen (α β _{7 7)} dimeriseren, wat tot volledig geassembleerd CP (α β _{7 7 7} α β _7). Dimerisatie tijdens de propeptiden in over ß-subeenhedenautokatalytische worden verwijderd, waardoor de katalytische N-terminale threoninen. Het gebruik van proteasomen Archaea montage model houdt vaak gebruik van de productie van recombinante archaea proteasoom eiwitten in Escherichia coli. Dit is een waardevolle benadering omdat het stelt de subeenheden worden geproduceerd in verschillende combinaties, zowel WT en mutante versies in een gastheerorganisme dat zijn eigen proteasomen niet produceert.

Monitoring van de assemblage van multi-eiwitcomplexen biochemisch vereist enige vorm van fractionering methode die volledig gemonteerd complexen van assemblage tussenproducten en voorlopers scheidt. Vanwege de superieure oplossen capaciteit denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) gebleken bijzonder bruikbaar bij de fractionering van diverse grote multiproteïnecomplexen ^14-17 zijn. De combinatie van recombinant archaea proteasoom productie en denaturerende PAGE is uitgegroeid tot een krachtige aanpak in dissecting proteasoom montage ^9,11,12,18. De gebruikelijke wijze waarop deze benadering wordt toegepast (bijv. Via de co-expressie van recombinant α en β-subeenheden) een belangrijk nadeel. Vergadering reacties zijn coöperatieve en sterk afhankelijk van de concentratie ^3. Aangezien de eiwitconcentratie in cellen is zeer hoog ¹⁹ vanwege uitgesloten volume-effecten, assemblage reacties verlopen in vivo snel. Daarom is het mogelijk om belangrijke assemblage tussenproducten missen als α en β subeenheden co-expressie gebracht.

Hier, we pleiten voor een gecombineerde aanpak in het onderzoek naar proteasoomafhankelijke assemblage het gebruik van recombinante Archaea proteasoom subunits. In deze benadering worden zowel co-expressie en lysaat mengmethoden gebruikt. De voormalige zorgt voor een snelle analyse van de montage, omdat co-expressie is minder arbeidsintensief. De laatste is afhankelijk van afzonderlijke expressie van α en β-subeenheden, gevolgd door mengen. Hoewel dit requires met enige moeite dan co-expressie is meer dan gecompenseerd door de mogelijkheid om tussenproducten die worden gemist tijdens co-expressie te detecteren. Samen kunnen deze twee methoden een vollediger beeld proteasoomafhankelijke samenstel.