Examiner Assemblée protéasome avec recombinant Archaeal Protéasomes et dénaturant PAGE: le cas pour une approche combinée

Complexes multiprotéiques effectuent de nombreuses activités cellulaires critiques ^1. Pour beaucoup de ces complexes, beaucoup plus on connaît leur structure et leur fonction que de leur assemblage ^2,3. Le protéasome est un tel complexe et se retrouve dans tous les domaines de la vie. Chez les eucaryotes, cette machine moléculaire est au cœur du système protéasome / Ubiquitin (UPS) et fournit la principale voie de dégradation des protéines intracellulaires ^4. Le protéasome eucaryote (dénommé protéasome 26S) est composé de deux ensembles principaux sous: un protéasome 20S, ou Core particules (CP) ^5, qui peut être coiffé sur une ou deux extrémités par une particule réglementaire 19S (RP) ^6.

Le protéasome 20S est une grande protéase compartimentée. Sa structure quaternaire est complètement conservée dans tous les domaines de la vie et se compose d'un empilement de quatre cycles à sept chaînons contenant au moins deux types de sous-unités de structure apparentée, α; et ß ^5,7,8. Chez les eucaryotes, les deux bagues extérieures sont chacune composées de sept sous-unités a différentes et les deux bagues intérieures sont constitués chacun de sept sous-unités ß distinctes; une activité protéolytique réside dans trois des sous-unités ß. En revanche, les anneaux de CP de archéobactéries et des bactéries sont habituellement constituées d'un seul type de α et une sous-unité β type. Proteasomes Archaea ont fourni un important système modèle pour étudier l' assemblage du protéasome due à la fois à leur simplicité de composition et de leur partager un mécanisme d'assemblage commun avec leurs homologues eucaryotes ^9-13. En bref, les sous-unités alpha assemblent en anneaux d'a d'abord, qui servent comme un échafaudage sur lequel ß sous-unités se rassemblent. Les demi-protéasomes résultant (α ₇ β ₇₎ dimériser, donnant lieu à des entièrement assemblés CP (α ₇ β ₇ β ₇ α _7). Au cours de la dimérisation, les propeptides présents sur les sous-unités ßsont enlevées par voie autocatalytique, ce qui expose les thréonines catalytique N-terminal. L'utilisation des protéasomes archéobactéries pour modéliser l' assemblage prend souvent l' avantage de la production de protéines recombinantes dans protéasome archéobactéries Escherichia coli. Cette approche est utile, car elle permet aux sous-unités à produire dans diverses combinaisons, à la fois comme WT et versions mutantes, dans un organisme hôte qui ne produit pas ses propres protéasomes.

Contrôle de l'assemblage des complexes multi-protéiques nécessite biochimiquement une sorte de méthode de fractionnement qui sépare les complexes entièrement assemblés à partir des intermédiaires d'assemblage et de précurseurs. En raison de sa capacité de résoudre supérieure, non dénaturant sur gel de polyacrylamide L' électrophorèse (PAGE) est avéré être particulièrement utile pour le fractionnement de divers grands complexes multiprotéiques ^14-17. La combinaison de la production de protéasome Archaea recombinant et PAGE dénaturant est devenue une approche puissante en dissecting assemblage de protéasome ^9,11,12,18. Cependant, la méthode habituelle par laquelle cette approche est appliquée ( par exemple. Par la co – expression recombinante de sous – unités a et ß) présente un inconvénient important. Les réactions de l' Assemblée sont coopératifs et fortement dépendante de la concentration ^3. Étant donné que la concentration de la protéine dans les cellules est très élevée ^19, en raison des effets de volume exclu, les réactions d'assemblage se déroulent rapidement in vivo. Il est donc possible de manquer des intermédiaires d'assemblage importants lorsque a et ß sous-unités sont coexprimaient.

Ici, nous plaidons pour une approche combinée à l'étude de l'ensemble de protéasome en utilisant des sous-unités du protéasome archées recombinantes. Dans cette approche, les deux méthodes de mélange coexpression et lysat sont utilisés. La première permet une analyse rapide de l'ensemble parce coexpression est moins de travail. Celle-ci dépend de l'expression séparée des sous-unités a et ß, suivi par le mélange. Bien que ce requires un peu plus d'effort que coexpression, il est plus que compensée par la capacité à détecter les intermédiaires qui sont manqués pendant coexpression. Ensemble, ces deux méthodes peuvent fournir une image plus complète de l'ensemble de protéasome.