Изучение вирусных векторов в Трехмерные модели печени заселен с клеточной линии человеческого гепатоцеллюлярной карциномой HepG2
Summary
The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.
Abstract
Этот протокол описывает генерацию трехмерной (3D) модель ех естественных условиях печени и его применение к изучению и развитию вирусных векторных систем. Модель получается заселив внеклеточного матрикса в decellularized печени крыс с линией гепатоцитов клеток человека. Модель позволяет исследования в васкуляризированной системе 3D клеток, заменяя потенциально опасные эксперименты с живыми животными. Еще одним преимуществом является гуманизированным характер модели, которая ближе к физиологии человека, чем на животных моделях.
В данном исследовании мы демонстрируем трансдукции этой модели печени с вирусным вектором, полученной из аденосателлитные вирусов (AAV вектор). Схема перфузия, которая поставляет 3D модель печени со средствами массовой информации обеспечивает легкое средство для применения вектора. Система позволяет осуществлять мониторинг основных параметров метаболизма печени. Для окончательного анализа, образцы тканей могут быть приняты, чтобы определить степень recellularizaции с помощью гистологических методов. Распределение вектора вируса и экспрессию доставленного трансгена могут быть проанализированы с помощью количественной ПЦР (КПЦР), Вестерн-блоттинга и иммуногистохимии. Многочисленные применения векторной модели в области фундаментальных исследований, так и в развитии генной терапевтических применений могут быть предусмотрены, в том числе разработки новых противовирусных терапевтических средств, исследования рака и изучения вирусных векторов и их возможных побочных эффектов.
Introduction
Most current biomedical research relies on one of two approaches, either two-dimensional (2D) cell culture experiments or animal models, which are three-dimensional (3D) by their very nature. However, these approaches have some severe drawbacks. Cells grown in 2D culture have been shown to differ in gene expression patterns and cell physiology from those cultivated under 3D conditions.1 Animal models, in addition to being associated with ethical concerns, often do not model human physiology well. Although the lack of obvious toxic effects of a compound must be confirmed in animal models prior to the first dosing in humans, multiple cases have been documented in which severe, sometimes fatal, adverse effects have occurred in clinical trials.2
To overcome these shortcomings, humanized 3D ex vivo organ models have become important research tools. When cultivated under suitable conditions, cells self-assemble into 3D structures known as spheroids. However, these spheroids lack a vascular system, which limits the distribution of small molecular compounds, large biologics and viral vectors alike. For example, adenoviral vectors only transduced the outer cell layers of spheroids prepared from human glioblastomas.3 A solution to this problem is the use of an organ model containing a vascular system. To this end, the organ of interest can be explanted from an animal, and the animal cells can be replaced by human cells. Various methods for decellularization of animal livers by treatment with detergents or sodium cholate have been described.4-6 The resulting extracellular matrix (ECM) harbors cytokines and growth factors which regulate various cellular processes.7 It can be used as a scaffold for recellularization with human cells to obtain a functional organ model.
In a recent study, we used a humanized 3D liver model to study distribution and transgene expression of an adeno-associated virus (AAV) vector.8 AAV vectors belong to the most promising viral vectors for gene therapeutic applications.9 The first, and to date only, approved gene therapeutic intervention in the Western world uses an AAV vector for the transfer of lipoprotein lipase.10
Protocol
Representative Results
Discussion
Восстановленные 3D Печень, описанные здесь, представляют собой модель для изучения вирусных векторов в гуманизированного системе. Репопуляции ЕСМ печени крыс с человеческим печеночно-клеточной линии карциномы формирует васкуляризированных систему, которая позволяет исследовать большие биопрепаратов. Эти результаты обеспечивают доказательство правильности концепции, что воссозданная модель печени может быть эффективно трансдуцированную вирусным вектором.
Для экспериментов, показанных здесь, каждый лепесток печени трансдуцированных вектором AAV. Тем не менее, в некоторых предварительных экспериментах, одиночные мочки были не заселена с клетками. Поэтому очень важно, чтобы предотвратить остатки клеток или других компонентов от закупоривания сосудистой системы. Чтобы проверить, может ли быть перфузию все лепестка, нетоксичный краситель, такой как фенол красный цвет может быть промыта через модель печени.
Другим важным вопросом является сохранение эшафот печени стерильными. В то время как лечение с этанолом или антибиотиками disadvantageous для сосудистой системы, при облучении внеклеточного матрикса с гамма-излучением сохранились сосуды и стерилизовать образца.
Кроме того, размер эксплантированной печенки будет отличаться, так что число клеток, используемых для процедуры recellularization и время репопуляция, возможно, придется быть отрегулирована, чтобы получить воспроизводимые результаты.
Печень крысы , используемые в настоящем исследовании , являются сравнительно большими и требуют большого количества клеток и контрольных реагентов (например, AAV векторы). Кроме того, процедура репопуляция потребовалось более двух недель. Это ограничивает число повторов, которые могут быть сделаны с разумными усилиями. Мы в настоящее время создание модели для печени мышей, которые являются лишь около одной пятой части объема печени крыс, что позволяет использовать меньшее количество клеток и меньше тестовых реагентов. Несмотря на то, пропорциональный масштаб вниз числа клеток представляется разумным, точные суммы должны быть определены в Furtее эксперименты.
Другим недостатком данной модели является использование гепатоцеллюлярной линии HepG2 клеток. Эксперименты продолжаются развивать использование гепатоцитов дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которые будут обеспечивать физиологически более соответствующую модель. Кроме того, печень состоит из нескольких типов клеток в дополнение к гепатоцитов, например, клетки Купфера и sinosoids. Мы предполагаем, что различные типы клеток будут заселить их естественной среде, когда ЕСМ recellularized с несколькими типами клеток.
Модель сочетает в себе 3D печени несколько преимуществ. Основным недостатком обычных в естественных условиях модели является то , что физиология животных существенно отличается от физиологии человека. Поэтому Токсические побочные эффекты лечения у пациента-человека, могут остаться незамеченными. Этот недостаток может быть преодолен путем восстановления модели печени 3D с человеческими клетками, которые более точно отражают биологию Huчеловек больных.
Второе преимущество модели печени является его вклад в благополучие животных. Хотя компоненты животного происхождения необходимы для экспериментов , восстановление влагосодержания, подход все еще следует цели принципа 3Р (замена, восстановления, рафинирования), а избыток животных можно использовать , которые были умерщвлены для других экспериментов на животных, то есть никаких дополнительных животные не нужны и подход полностью исключает страдания животных , которые часто ассоциируется с экспериментами в естественных условиях. Spheroids являются альтернативным инструментом для изучения клеточных процессов в системе 3D. Тем не менее, сфероиды не васкуляризации, так что большие вещества и биопрепараты не проникают глубоко во внутренние части конструкции. Эти проблемы были преодолены с сосудами 3D модели печени.
В экспериментах, описанных здесь, векторы AAV были исследованы, так как они являются одними из наиболее перспективных кандидатов для генной терапевтическихПриложения. Поскольку многочисленные генные терапевтические подходы направлены на нацеливание на печень, например, для лечения инфекций, вызванных вирусами гепатита или недостаточности альфа-1-антитрипсина, 3D печени может быть использован в процессе этих ААВ вектора развития. Это, конечно, подходит также для изучения других гепатотропными вирусных векторов, например, аденовирусные векторы. Кроме того, он может быть использован для изучения инфекционных вирусов гепатита, таких как гепатит В или вирусом C. Он может, например, быть использованы для разработки новых противовирусных стратегий. Кроме того, 3D-модели органа представляют перспективные инструменты для разработки новых цитостатических терапии для лечения рака и для проведения токсикологических исследований. На конечном счете, искусственные Печени могут быть использованы в регенеративной медицине в качестве трансплантатов. Взятые вместе, 3D модель печени предлагает широкий спектр применения в биологии инфекции и других областях биомедицинских исследований.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Bernd Krostitz for technical assistance, Radoslaw Kedzierski for initial contributions to the project, Erik Wade for proofreading and giving helpful comments, and Prof. Heike Walles for providing the bioreactor and sharing her valuable experience with organ decellularization. We are also thankful for funding of the project and publication by the Berlin University of Technology.
Materials
| Incubator | Fraunhofer | / | |
| Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
| Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
| O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
| Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
| Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
| Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
| Screw Cap | Duran | 2924013 | |
| Screw Cap | Duran | 2924008 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
| Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
| Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
| Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
| Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
| T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicillin/ streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15x15x5mm | Sakura | 4566 | |
| Biopsy punch 4mm | pfm medical | 48401 | |
| Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |
References
- Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes. Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).
- Butler, D., Callaway, E. Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal. Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).
- Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029 (2015).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).
- Wagner, A., et al. Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors. J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).
- Kay, M. A. State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).
- Yla-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard. Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).
- Takagi, H., et al. Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR. J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).
