Studie von viralen Vektoren in einem dreidimensionalen Modell der Leber neu besiedelt mit dem menschlichen hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2

HINWEIS: RL erhalten ethische Genehmigung für die Explantation von Organen aus dem Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Die Lebern wurden von Wistar-Ratten explantiert. Die untere Hohlvene und die Pfortader der Leber wurden mit einer 22 G Kanüle kanüliert. Verfahren zur Dezellularisierung von explantierten Lebern wurden zuvor beschrieben. 4,5 die extrazellulären Matrizes hier verwendet wurden mit 1% Natriumdesoxycholat durch übermäßige Perfusion eines Rattenleber erhalten. 1. Rezellularisierung der extrazellulären Matrix (ECM) von einer Rattenleber Erweiterung der Leberzelllinie HepG2 Kultur der hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2 in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 2 mM Penicillin und Streptomycin, jede. Samen 1,5 x 10 7 Zellen in T175 – Flaschen und wachsen , um die Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 </sub>. Ernte Zellen nach 4 Tagen durch Trypsinisierung für 5 min bei 37 ° C, 5% CO 2. Drehen Sie die Zellen bei 300 g nach unten und resuspendieren sie in 4 ml PBS und zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer unter dem Mikroskop. Eine T175 Flasche wird etwa 4,5 x 10 7 Zellen ergeben. HINWEIS: Sicherstellen , dass die Kultur für Rezellularisierung der Rattenleber ECM ausreichende Zellzahlen enthält mit 6 x 10 8 HepG2 Zellen pro ECM (10 x 175 cm 2 Kulturflaschen mit 4-5 x 10 8 Zellen pro Stück). Abbildung 1. Bioreactor – System. A) Das Bioreaktorsystem war maßgeschneidert. Es erhält die Organmodelle bei 37 ° C und 5% CO 2. Die Strömungsraten der peristaltischen Pumpen können einzeln geregelt werden. B) Die Leber ist in einer Wachstumskammer angeordnet und verbindened zur Perfusionskreislaufes, die aus einer Schlauchpumpe besteht, ein Mittelreservoir, eine Blasenfalle und einem Drucksensor. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Rezellularisierung des ECM Stellen Sie den Bioreaktor-System, eine Leber-Perfusionskammer, eine Perfusions-System, ein Reservoir von Medium und eine Blasenfalle enthält. Sterilisieren des Bioreaktors System (121 ° C, 15 min). Schließen Sie das Bioreaktorsystem mit einer Schlauchpumpe und legen Sie sie in einen Inkubator geeigneten Bedingungen die Bereitstellung (37 ° C, 5% CO 2). Platzieren dezellularisiert Rattenleber Gerüste 8 in der Leber Perfusionskammer des Bioreaktorsystems (Abbildung 1). Schließen Sie den kanülierten Pfortader und Hohlvene mit Schlauchschellen mit dem Perfusionssystem. Äquilibrieren Gerüst mit 150 ml RPMI-Medium (wie in 1.1 beschrieben)über 5 d mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,25 ml / min. Trennen Sie das Lebergerüstes aus der Medien Schaltung und impfen das Gerüst mit 3 x 10 8 HepG2 – Zellen (in 5 ml) über die Pfortader eine 5 ml – Spritze, Luftblasenbildung vermieden werden und die Zellen das ECM neu zu besiedeln , indem sie Inkubation 1 Stunde in das Gerüst mit der Pumpe abgeschaltet. Erhöhen Sie die Durchflussrate durch die Pumpe eingestellt wird, beginnend mit 1,25 ml / min für 10 min; 2,5 ml / min für 20 min und schließlich 3,75 ml / min für 30 min. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.4-1.2.5 eine Gesamtzellzahl von 6 x 10 8 zu erreichen. Führen Sie die Bioreaktorsystem bei einer Fließgeschwindigkeit von 3,75 ml / min. Kultur der rezellularisiertes Rattenleber für 2 Wochen. HINWEIS: Ersetzen Sie ein Drittel des Mediums mit frischem Medium (50 ml) jeden zweiten Tag. Probe des Kulturmediums physiologische Parameter, wie Lactat-Dehydrogenase-Aktivität, der pH-Wert von Mediumproben und der Konzentration von Glukose und Laktat zu messen. 2. Transduktion der rezellularisiertes Rat Liver Die Großproduktion von AAV-Vektoren Produzieren, zu reinigen und zu quantifizieren , AAV – Vektoren , wie zuvor beschrieben: 11 AAV-Vektoren in Rollflaschen Kurz gesagt, produzieren und reinigen sie von Iodixanol-Zentrifugation. Entfernen Rest Iodixanol durch Filtration über PD10 Gelfiltrationssäulen. Bestimmung der AAV-Vektor-Konzentration durch qPCR unter Verwendung von genomischer DNA AAV als Standard. HINWEIS: Die selbstkomplementären, pseudotypisierten AAV 2 /6 Vektor in der vorliegenden Studie verwendeten codierten EmGFP als Reporter Transduktionseffizienz und eine shRNA – Expressionskassette für die Zuschlags eines endogen exprimierten Gens (human Cyclophilin B (hCycB), Abbildung 2) zu zeigen , . Achten Sie darauf , eine ausreichende Menge an pseudotypisiertem scAAV Vektoren des Serotyps 6 (2,7 x 10 13 AAV – Vektoren pro Leber – Modell). Abbildung 2. Karte des selbstkomplementären, pseudotypisierten AAV2 / 6 – Vektor in der vorliegenden Studie verwendet. Das Genom besteht aus den Inverted Terminal Repeats (ITR) von AAV2 und codiert EmGFP unter der Kontrolle des CMV – Promotors sowie eine shRNA unter der Kontrolle eines U6 – Promotors. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Transduction von Lebermodell Stellen Sie die AAV – Vektor – Lösung auf eine Endkonzentration von 2,7 x 10 13 Vektorgenomen in 5 ml durch das jeweilige Volumen PBS hinzugefügt wird . Trennen Sie die Leber aus der Medienkreislauf durch den Schlauch aus der Kanüle entfernen. Schließen Sie eine 5-ml-Spritze mit der Kanüle der Pfortader und injizieren die vollständige AAV-Vektor-Lösung (5 ml). HINWEIS: Optionally, Phenolrot (5 ug / ml) hinzufügen, um die Verteilung des AAV-Vektor-Lösung in der gesamten Leber zu folgen. Inkubieren für 1 Stunde, ohne zu pumpen. Nach und nach Strömungsgeschwindigkeit zu erhöhen, mit 1,25 ml Start / min für 10 min; 2,5 ml / min für 20 min und 3,75 ml / min für 30 min. Kultur der rezellularisiertes Rattenleber über 6 Tage. HINWEIS: Ein Drittel des Mediums ersetzen, wie in Anmerkung unter 1.2.7 gegeben 3. Bewertung des rezellularisiertes transduzierten Rattenleber Hematoxylin und Eosin (HE) Färbung und immunhistochemische Analyse Nehmen Sie Proben (0,5 x 0,5 x 1,5 bis 2 cm) aus jeder Leberlappen mit einem Skalpell. Inkubieren Proben (aus 3.1.1) in 4% Paraformaldehyd (PFA) + 4% Saccharose-Lösung für 1,5 h bei 4 ° C. (Achtung: PFA ist giftig und krebserregend immer PFA halten innerhalb einer Abzugshaube und entsprechende Schutzkleidung tragen..) Waschen dreimal mit PBS (1 min pro Waschschritt) und Inkubation in 8%Saccharose über Nacht bei 4 ° C. Gießen Medium in Kunststoff cryomolds Fixierung, legen Sie die Proben in Befestigungsmedium frei von Luftblasen. In Befestigungsmedium, bis Probe wird gut abgedeckt. Lagern Sie die Proben bis zur weiteren Verwendung bei -80 ° C eingebettet. Bereiten cryo Schnitte (10 um) mit einem Kryotom 12. Beurteilen Sie Rezellularisierung von Hämatoxylin + Eosin – Färbung 8. Beurteilen Sie Transduktionseffizienz durch immunhistochemische Färbung für das Gen von Interesse (hier: EmGFP). Molekularbiologische Probenahme Probe jedes Leberlappen mit einem Biopsiestanze (4 mm im Durchmesser). Isolieren der Gesamt – RNA, DNA und Proteine gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Beurteilung der transgenen Expression von EmGFP und hCycB knock down 8.