Studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever Model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2

LET OP: RL verkregen ethische goedkeuring voor de explantatie van organen van de Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Levers werden geëxplanteerd uit Wister ratten. De onderste vena cava en de poortader van de lever werden gecannuleerd met een 22 G canule. Werkwijzen voor het van cellen ontdoen van geëxplanteerde levers zijn eerder beschreven. 4,5 Het extracellulaire matrices die hier gebruikt werden verkregen door overmatige perfusie van een rattenlever met 1% natriumdeoxycholaat. 1. hercellularisatie van extracellulaire matrix (ECM) van een rattenlever Uitbreiding van de lever cellijn HepG2 Cultuur hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2 in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 2 mM glutamine en 2 mM penicilline en streptomycine, elk. Zaad 1,5 x 10 7 cellen in T175 flessen en groeien de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 </sub>. Oogst cellen na 4 dagen van behandeling met trypsine gedurende 5 minuten bij 37 ° C, 5% CO2. Spin down de cellen bij 300 xg en resuspendeer ze in 4 ml PBS en tel de cellen met een Neubauer kamer onder een microscoop. Eén T175 fles zal ongeveer 4,5 x 10 7 cellen opleveren. LET OP: Zorg ervoor dat de cultuur bevat voldoende mobiele nummers voor hercellularisatie van de rat lever ECM met 6 x 10 8 HepG2 cellen per ECM (10 x 175 cm 2 cultuur kolven met 4-5 x 10 8 cellen elk). Figuur 1. Bioreactor-systeem. A) Deze bioreactor systeem werd op maat gemaakt. Het handhaaft de orgaanmodellen bij 37 ° C en 5% CO2. De stroomsnelheden van de peristaltische pompen individueel regelbaar. B) De lever wordt in een groeikamer en sluitened aan de perfusie circuit, die bestaat uit een peristaltische pomp, een medium reservoir, een zeepbel val en een druksensor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Hercellularisatie van de ECM Stel de bioreactor systeem, dat een lever perfusie kamer, een perfusie-systeem, een reservoir van medium en een zeepbel te houden. Steriliseer het bioreactorsysteem (121 ° C, 15 min). Sluit het bioreactorsysteem met een peristaltische pomp en plaats deze in een incubator passende omstandigheden (37 ° C, 5% CO2). Plaats ontceld rattenlever scaffolds 8 in de leverperfusie kamer van het bioreactorsysteem (figuur 1). Sluit de ader canule portal en vena cava met behulp van slangklemmen aan de perfusie-systeem. Equilibreren steiger met 150 ml RPMI medium (zoals beschreven in 1.1)dan 5 d met een stroomsnelheid van 1,25 ml / min. Koppel de lever steiger van de media circuit en het enten van het schavot met 3 x 10 8 HepG2-cellen (in 5 ml) via de poortader met behulp van een 5 ml spuit, vermijd luchtbel vorming en laat de cellen naar de ECM herbevolken door ze te incuberen 1 uur in de steiger met de pomp uitgeschakeld. Verhoog geleidelijk de stroomsnelheid door instelling van de pomp, beginnend met 1,25 ml / min gedurende 10 min; 2,5 ml / min gedurende 20 min en tenslotte 3,75 ml / min gedurende 30 min. Herhaal de stappen 1.2.4-1.2.5 tot een totaal aantal cellen van 6 x 10 8 te bereiken. Voer het bioreactorsysteem met een stroomsnelheid van 3,75 ml / min. Cultuur de recellularized rat lever voor 2 weken. OPMERKING: Vervang een derde van het medium door vers medium (50 ml) om de dag. Proef het kweekmedium fysiologische parameters, zoals lactaat dehydrogenase activiteit, de pH van mediummonsters en de concentratie van glucose en lactaat meten. 2. Transductie van de Recellularized Rat Liver Grootschalige productie van AAV vectoren Produceren, zuiveren en kwantificeren van AAV-vectoren zoals eerder beschreven: 11 In het kort, de productie van AAV-vectoren in rolflessen en te zuiveren hen door iodixanol gradiënt centrifugeren. Resten iodixanol door filtratie over PD10 gelfiltratiekolommen. Bepaal de AAV vector concentratie qPCR gebruikmaking van genomisch DNA AAV als standaard. Opmerking: Het zelf-complementaire gepseudotypeerde AAV2 / 6 vector gebruikt in de onderhavige studie gecodeerd EmGFP als reporter transductie efficiëntie en een shRNA expressiecassette voor knockdown van een endogeen tot expressie gebracht gen (humaan cyclofiline B (hCycB), figuur 2) tonen . Zorg voor een voldoende hoeveelheid pseudo scAAV vectoren serotype 6 (2,7 x 10 13 AAV-vectoren per lever model). Figuur 2. Kaart van het zelf-complementaire gepseudotypeerde AAV2 / 6 vector gebruikt in de onderhavige studie. Het genoom bestaat uit de omgekeerde eindstandige herhalingen (ITR) van AAV2 en codeert EmGFP onder controle van de CMV promoter en een onder controle shRNA van een U6 promotor. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Transductie van de lever Model Stel de AAV vector oplossing tot een eindconcentratie van 2,7 x 10 13 vector genoom in 5 ml door toevoeging van het desbetreffende volume PBS. Koppel de lever van de media circuit door het verwijderen van de slang van de canule. Sluit een 5 ml spuit met de canule van de vena portae en injecteer totale AAV vector-oplossing (5 ml). LET OP: Optionally, voeg fenolrood (5 ug / ml) verspreiding van de AAV vector oplossing gehele lever volgen. Incubeer gedurende 1 uur zonder pompen. Verhoog geleidelijk stroomsnelheid, beginnend met 1,25 ml / min gedurende 10 min; 2,5 ml / min gedurende 20 min en 3,75 ml / min gedurende 30 min. Cultuur de recellularized rat lever meer dan 6 dagen. OPMERKING: Vervang een derde van het medium, zoals aangegeven in OPMERKING onder 1.2.7 3. Beoordeling van de Recellularized getransduceerde Rat Liver Hematoxyline en eosine (HE) kleuring en immunohistochemische analyse Monsters te nemen (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) van elkaar leverkwab met behulp van een scalpel. Incubeer monsters (van 3.1.1) in 4% paraformaldehyde (PFA) + 4% sucrose oplossing 1,5 uur bij 4 ° C. (Let op: PFA is giftig en kankerverwekkend Altijd PFA binnen een zuurkast en draag geschikte beschermende kleding..) Was drie keer met PBS (1 min per wasbeurt stap) en incubeer bij 8%sucrose overnacht bij 4 ° C. Giet de vaststelling medium in plastic cryomolds, plaatst de monsters in de vaststelling medium vrij van luchtbellen. Voeg vaststelling medium tot monster goed bedekt is. WINKEL ingebedde monsters bij -80 ° C tot verder gebruik. Bereid cryo-secties (10 pm) met een cryotoom 12. Assess hercellularisatie door hematoxyline + eosinekleuring 8. Assess transductie efficiency door immunohistochemische kleuring voor het gen-van-belang (hier: EmGFP). Moleculair biologische monsters Elk monster leverkwab een biopsie pons (4 mm diameter). Isoleer totaal RNA, DNA en eiwitten volgens de instructies van de fabrikant voor de beoordeling van transgene expressie van EmGFP en hCycB knock down 8.