دراسة ناقلات فيروسية في الكبد نموذج إسكانها ثلاثي الأبعاد مع الخط خلية الإنسان سرطان الكبد HepG2
Summary
The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.
Abstract
يصف هذا البروتوكول جيل من ثلاثي الأبعاد (3D) فيفو السابقين نموذج الكبد وتطبيقه على دراسة وتطوير أنظمة النواقل الفيروسية. يتم الحصول على النموذج من خلال إعادة إسكانها المصفوفة خارج الخلية من كبد الفئران decellularized مع خط الخلية الكبدية البشري. يسمح نموذج دراسات في نظام خلية 3D أوعية دموية، لتحل محل التجارب يمكن أن تكون ضارة بالحيوانات الحية. ميزة أخرى هي طبيعة أنسنة النموذج، الذي هو أقرب إلى علم وظائف الأعضاء البشرية من النماذج الحيوانية.
في هذه الدراسة، ونحن لشرح تنبيغ هذا النموذج الكبد مع ناقل فيروسي المستمدة من الفيروسات الغدة المرتبطة (ناقلات AAV). الدائرة نضح التي تزود نموذج الكبد 3D مع وسائل الإعلام توفر وسيلة سهلة لتطبيق النواقل. ويسمح نظام رصد المعلمات الأيض الرئيسية للكبد. من التحليل النهائي، وعينات الأنسجة التي يمكن اتخاذها لتحديد مدى recellularizaنشوئها من خلال تقنيات النسيجية. توزيع ناقلات الفيروس والتعبير عن التحوير تسليمها يمكن تحليلها بواسطة PCR الكمي (QPCR)، غرب النشاف والمناعية. العديد من التطبيقات للنموذج متجه في البحوث الأساسية وتطوير التطبيقات العلاجية الجينات يمكن تصوره، بما في ذلك تطوير علاجات مضادة للفيروسات جديدة، وأبحاث السرطان، ودراسة النواقل الفيروسية والآثار الجانبية المحتملة.
Introduction
Most current biomedical research relies on one of two approaches, either two-dimensional (2D) cell culture experiments or animal models, which are three-dimensional (3D) by their very nature. However, these approaches have some severe drawbacks. Cells grown in 2D culture have been shown to differ in gene expression patterns and cell physiology from those cultivated under 3D conditions.1 Animal models, in addition to being associated with ethical concerns, often do not model human physiology well. Although the lack of obvious toxic effects of a compound must be confirmed in animal models prior to the first dosing in humans, multiple cases have been documented in which severe, sometimes fatal, adverse effects have occurred in clinical trials.2
To overcome these shortcomings, humanized 3D ex vivo organ models have become important research tools. When cultivated under suitable conditions, cells self-assemble into 3D structures known as spheroids. However, these spheroids lack a vascular system, which limits the distribution of small molecular compounds, large biologics and viral vectors alike. For example, adenoviral vectors only transduced the outer cell layers of spheroids prepared from human glioblastomas.3 A solution to this problem is the use of an organ model containing a vascular system. To this end, the organ of interest can be explanted from an animal, and the animal cells can be replaced by human cells. Various methods for decellularization of animal livers by treatment with detergents or sodium cholate have been described.4-6 The resulting extracellular matrix (ECM) harbors cytokines and growth factors which regulate various cellular processes.7 It can be used as a scaffold for recellularization with human cells to obtain a functional organ model.
In a recent study, we used a humanized 3D liver model to study distribution and transgene expression of an adeno-associated virus (AAV) vector.8 AAV vectors belong to the most promising viral vectors for gene therapeutic applications.9 The first, and to date only, approved gene therapeutic intervention in the Western world uses an AAV vector for the transfer of lipoprotein lipase.10
Protocol
Representative Results
Discussion
كبد 3D أعيد الموصوفة هنا تقدم نموذجا لدراسة ناقلات فيروسية في نظام إنساني. إعادة تعمير ECM من كبد الفئران مع خط خلايا سرطان الكبد البشري يولد نظام أوعية دموية الذي يسمح للدراسة البيولوجية الكبيرة. وتوفر هذه النتائج إثبات صحة مفهوم أن النموذج الكبد أعيد يمكن transduced بكفاءة مع ناقل فيروسي.
لالتجارب هو موضح هنا، تم transduced كل فص من الكبد عن طريق ناقلات AAV. ومع ذلك، في بعض التجارب الأولية، لم إسكانها الفصوص واحدة مع الخلايا. ولذلك فمن المهم لمنع الحطام الخلية أو المكونات الأخرى من يسد الأوعية الدموية. لاختبار ما إذا كانت جميع فصوص يمكن perfused، صبغة غير سامة مثل الفينول الأحمر يمكن أن يتم مسح من خلال نموذج الكبد.
مسألة حاسمة أخرى هو الحفاظ على سقالة الكبد عقيمة. بينما العلاج مع الإيثانول أو المضادات الحيوية هي disadvantageous لنظام الأوعية الدموية، تشعيع المصفوفة خارج الخلية مع γ للإشعاع الحفاظ على السفن وتعقيم العينة.
وعلاوة على ذلك، فإن حجم كبد explanted تختلف، لذلك قد يكون عدد الخلايا المستخدمة لإجراء recellularization والوقت إعادة تعمير لتعديلها للحصول على نتائج قابلة للتكرار.
أكباد الفئران المستخدمة في الدراسة الحالية هي كبيرة نسبيا وتحتاج إلى كميات كبيرة من الخلايا والكواشف الاختبار (على سبيل المثال، ناقلات AAV). وبالإضافة إلى ذلك، اتخذ إجراءات إعادة تعمير أكثر من أسبوعين. وهذا يحد من عدد من مكررات الذي يمكن القيام به مع جهد معقول. نحن حاليا بإنشاء نموذج للكبد الفأر، والتي هي فقط ما يقرب من خمس حجم كبد الفئران، والسماح باستخدام عدد أقل من الخلايا وأقل الكواشف الاختبار. على الرغم من أن يتناسب حجم أسفل من عدد الخلايا يبدو معقولا، تحتاج إلى أن تحدد في furt المبالغ الدقيقةتجارب لها.
وثمة عيب آخر من النموذج الحالي هو استخدام خط الخلية HepG2 الكبد. التجارب مستمرة لتطوير استخدام خلايا الكبد متباينة من الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها، والتي سوف تقدم نموذجا من الناحية الفسيولوجية أكثر أهمية. وعلاوة على ذلك، والكبد يتكون من أنواع الخلايا متعددة بالإضافة إلى خلايا الكبد، على سبيل المثال، خلايا كوبفر وsinosoids. ونحن نفترض أن أنواع مختلفة من الخلايا وإعادة النشرات بيئاتها الطبيعية عند recellularized إدارة المحتوى في المؤسسة مع أنواع خلايا متعددة.
نموذج الكبد 3D يجمع العديد من المزايا. والعيب الرئيسي للالتقليدية في النماذج الحية هو أن فسيولوجيا الحيوان يختلف كثيرا عن علم وظائف الأعضاء البشرية. وبالتالي قد تبقى الآثار الجانبية السامة لعلاج المريض البشري التي لم يتم كشفها. هذا القصور يمكن التغلب عليها عن طريق إعادة تشكيل نموذج الكبد 3D مع الخلايا البشرية التي تعكس بشكل وثيق بيولوجيا هو جين تاوالمرضى الرجل.
الميزة الثانية من طراز الكبد هي مساهمته في رعاية الحيوان. على الرغم من أن مكونات الحيوان مطلوبة من أجل التجارب إعادة، ونهج لا يزال يتبع أهداف مبدأ 3R (استبدال، والحد، والصقل)، والحيوانات الفائضة يمكن استخدامها التي ضحى من التجارب على الحيوانات الأخرى، أي هناك حاجة إلى أي الحيوانات إضافية و النهج يتجنب تماما معاناة الحيوانات التي كثيرا ما يرتبط مع التجارب في الجسم الحي. الكروية هي أداة بديلة لدراسة العمليات الخلوية في نظام 3D. ومع ذلك، لا أوعية دموية الكروية ذلك أن المواد الكبيرة والبيولوجية لا تخترق عميقا في الأجزاء الداخلية للهيكل. وقد تم التغلب على هذه المشاكل مع نموذج الكبد 3D أوعية دموية.
في التجارب وصفها هنا، تم التحقيق ناقلات AAV، لأنها هي من بين المرشحين الواعدين لالعلاجية الجينالتطبيقات. كما تهدف النهج العلاجية العديد من الجينات في استهداف الكبد، على سبيل المثال، لعلاج العدوى بفيروسات التهاب الكبد أو نقص ألفا 1-انتيتريبسين، والكبد 3D يمكن استخدامها في عملية تطوير هذه ناقلات AAV. هو، بطبيعة الحال، ومناسبة أيضا لدراسة ناقلات أخرى كبدي التوجه الفيروسية، على سبيل المثال، وناقلات الفيروسة الغدانية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامه لدراسة فيروسات التهاب الكبد المعدية مثل التهاب الكبد B أو C الفيروس. ويمكن، على سبيل المثال، أن تستخدم لتصميم الاستراتيجيات المضادة للفيروسات جديدة. وعلاوة على ذلك، ونماذج الجهاز 3D تمثل أدوات واعدة لتطوير علاجات تثبيط الخلايا الجديدة لعلاج السرطان وإجراء دراسات السمية. على المدى الطويل، الكبد الاصطناعي يمكن استخدامها في الطب التجديدي كما زرع. معا، ونموذج الكبد 3D يقدم مجموعة واسعة من التطبيقات في مجال البيولوجيا العدوى وغيرها من مجالات البحوث الطبية الحيوية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Bernd Krostitz for technical assistance, Radoslaw Kedzierski for initial contributions to the project, Erik Wade for proofreading and giving helpful comments, and Prof. Heike Walles for providing the bioreactor and sharing her valuable experience with organ decellularization. We are also thankful for funding of the project and publication by the Berlin University of Technology.
Materials
| Incubator | Fraunhofer | / | |
| Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
| Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
| O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
| Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
| Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
| Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
| Screw Cap | Duran | 2924013 | |
| Screw Cap | Duran | 2924008 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
| Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
| Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
| Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
| Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
| T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicillin/ streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15x15x5mm | Sakura | 4566 | |
| Biopsy punch 4mm | pfm medical | 48401 | |
| Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |
References
- Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes. Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).
- Butler, D., Callaway, E. Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal. Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).
- Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029 (2015).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).
- Wagner, A., et al. Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors. J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).
- Kay, M. A. State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).
- Yla-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard. Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).
- Takagi, H., et al. Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR. J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).
