Insan hepatoselüler karsinoma hücre hattı HepG2 ile üç boyutlu Karaciğer modeli yeniden doldurulur Viral Vektörler Study
Summary
The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.
Abstract
Bu protokol, üç boyutlu (3D) üretilmesini eks vivo karaciğer modeli ve viral vektör sistemleri çalışma ve gelişime uygulamaları açıklanmıştır. Model, insan hepatosit hücre hattı ile hücresizleştirilmiş sıçan karaciğer dışı matris repopulating ile elde edilir. Model yaşayan hayvanların potansiyel olarak zararlı deneyler yerine, bir vaskülarize 3D hücre sistemi çalışmaları izin verir. Diğer bir avantajı hayvan modellerinde daha insan fizyolojisi yakın olan modelin, insanlaştınlmış doğasıdır.
Bu çalışmada, adeno-ilişkili virüs (AAV vektörü) elde edilen bir viral vektör ile karaciğer modelinin transdüksiyonunu göstermektedir. medya ile 3D karaciğer modeli malzemeleri perfüzyon devre vektör uygulamak için kolay bir yol sağlar. Sistem karaciğer başlıca metabolik parametrelerin izlenmesini sağlar. Nihai analiz için, doku örnekleri recellulariza kapsamını belirlemek için alınabilirhistolojik teknikler ile yon. teslim transgenin virüs vektörü ve ekspresyon dağılımı kantitatif PCR (qPCR), Western blot ve immünohistokimya ile analiz edilebilir. Temel araştırma ve gen terapötik uygulamalarının geliştirilmesi vektör modelinin çok sayıda uygulama yeni antiviral terapötik maddelerin geliştirilmesi, Cancer Research, ve viral vektörlerin çalışma ve potansiyel yan etkileri de dahil olmak üzere, tasavvur edilebilir.
Introduction
Most current biomedical research relies on one of two approaches, either two-dimensional (2D) cell culture experiments or animal models, which are three-dimensional (3D) by their very nature. However, these approaches have some severe drawbacks. Cells grown in 2D culture have been shown to differ in gene expression patterns and cell physiology from those cultivated under 3D conditions.1 Animal models, in addition to being associated with ethical concerns, often do not model human physiology well. Although the lack of obvious toxic effects of a compound must be confirmed in animal models prior to the first dosing in humans, multiple cases have been documented in which severe, sometimes fatal, adverse effects have occurred in clinical trials.2
To overcome these shortcomings, humanized 3D ex vivo organ models have become important research tools. When cultivated under suitable conditions, cells self-assemble into 3D structures known as spheroids. However, these spheroids lack a vascular system, which limits the distribution of small molecular compounds, large biologics and viral vectors alike. For example, adenoviral vectors only transduced the outer cell layers of spheroids prepared from human glioblastomas.3 A solution to this problem is the use of an organ model containing a vascular system. To this end, the organ of interest can be explanted from an animal, and the animal cells can be replaced by human cells. Various methods for decellularization of animal livers by treatment with detergents or sodium cholate have been described.4-6 The resulting extracellular matrix (ECM) harbors cytokines and growth factors which regulate various cellular processes.7 It can be used as a scaffold for recellularization with human cells to obtain a functional organ model.
In a recent study, we used a humanized 3D liver model to study distribution and transgene expression of an adeno-associated virus (AAV) vector.8 AAV vectors belong to the most promising viral vectors for gene therapeutic applications.9 The first, and to date only, approved gene therapeutic intervention in the Western world uses an AAV vector for the transfer of lipoprotein lipase.10
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada anlatılan yeniden 3D karaciğerleri insanlaştırılmış sistemde viral vektörlerin incelemek için bir model. Bir insan hepatoselüler karsinoma hücre hattı ile, bir sıçan karaciğer ECM popülasyonu büyük biyolojik çalışmasına izin verir vaskülarize sistemi oluşturur. Bu sonuçlar, bir proof-of-concept sulandırılmış karaciğer modeli verimli bir viral vektör ile transduced olabilir sağlar.
Burada gösterilen deney için, karaciğer her lobun AAV vektör ile kalıt edildi. Bununla birlikte, bazı ön deneylerde tek loblar hücreleri ile yeniden doldurulur değildi. Vasküler sistem kapatılmasıy hücre artıkları ya da diğer bileşenleri bilmek önemlidir. Tüm lobu perfüze edilip edilemeyeceğini test etmek için, örneğin fenol kırmızısı gibi toksik olmayan boya karaciğer modeli ile temizlenebilir.
Bir başka önemli madde steril karaciğer iskele tutuyor. etanol ya da antibiyotikler ile tedavi disadv ikenantageous vasküler sistem için, γ-radyasyonla hücre dışı matrisin ışınlama damarları korunmuş ve örnek sterilize edilmiştir.
Recellularization prosedürü ve repopulation defa kullanılan hücre sayısı yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için ayarlanması gerekebilir, böylece Ayrıca, eksplante karaciğerler büyüklüğü, farklı olacaktır.
Bu çalışmada kullanılan fare karaciğerleri nispeten büyüktür ve hücre ve test reaktifleri (örneğin, AAV vektörleri) ihtiyaç duyar. Buna ek olarak, yeniden çoğalması prosedürü iki haftadan fazla sürmüştür. Bu makul bir çaba ile yapılabilir çoğaltır sayısını sınırlar. Şu anda daha az hücre ve daha az test reaktiflerinin kullanımına izin veren, sıçan karaciğerinden hacminin yalnızca yaklaşık beşte biri olan fare karaciğerleri, modelini kurmaktadır. Hücre sayısının oransal ölçek aşağı makul görünse de, kesin miktarlar furt tespit edilmesi gerekenOnun deneyleri.
Bu modelin bir diğer sakıncası hepatoselüler HepG2 hücre hattı kullanılmasıdır. Deneyler fizyolojik daha alakalı bir model sağlayacak uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt hepatositlerin kullanımını geliştirmek için çalışmalar devam etmektedir. Ayrıca, karaciğer hepatositleri, örneğin, Kupffer hücreleri ve sinosoids ek olarak birden çok hücre tipinde oluşur. Biz bir ECM birden fazla hücre tipleri ile recellularized zaman farklı hücre tipleri kendi doğal ortamları yeniden doldurmak olacağını varsayıyorum.
3D karaciğer modeli birçok avantajlarını birleştirir. In vivo modeller, geleneksel önemli bir dezavantajı, Bitki Fizyolojisi, insan fizyolojisinin esasen farklı olmasıdır. bir insan hastanın tedavisi için toksik yan etkileri, bu nedenle tespit edilmemiş kalabilir. Bu eksiklik daha yakından hu biyolojisini yansıtan insan hücreleri ile 3D karaciğer modeli sulandırılması ile aşılabiliradam hasta.
Karaciğer modelinin ikinci avantajı hayvan refahına katkısı olduğunu. Hayvan bileşenleri yeniden oluşturma deneyleri için gerekli olsa da fazlası hayvanlar, yani, herhangi bir ek hayvan gereklidir, diğer hayvan deneyleri için kurban edildi ve kullanılabilir olduğu, bu yaklaşım hala, 3R prensibi (değiştirme, redüksiyon, arıtma) amaçlarını aşağıdaki yaklaşımı tamamen sıkça in vivo deneyler ile ilişkili hayvanların acı önler. Sferoidler 3D sisteminde hücresel süreçleri incelemek için alternatif bir araçtır. Büyük maddeler ve biyolojik yapının iç bölüme derinlemesine nüfuz kalmaması Ancak, sferoidler vaskülarize değildir. Bu sorunlar vaskülarize 3D karaciğer modeli ile aşılmıştır.
bunlar, gen terapi uygulamaları için en ümit verici adaylar arasında, çünkü burada tarif edilen deneylerde, AAV vektörleri, araştırılmıştırUygulamalar. Gibi çok sayıda gen terapötik yaklaşımlar hepatit virüsü veya alfa-1 antitripsin eksikliği enfeksiyonlarının tedavisi için, örneğin, karaciğer hedefleme amaçlamaktadır, 3D karaciğer bu AAV vektörü geliştirme sürecinde kullanılabilir. Ayrıca, tabii ki, diğer hepatotropik viral vektörler, örneğin, adenoviral vektörlerin çalışma için uygundur. Buna ek olarak, hepatit B ya da C virüsü gibi bulaşıcı hepatit virüsleri incelemek için kullanılabilir. Örneğin, yeni bir antiviral stratejiler tasarlamak için de kullanılabilir. Ayrıca, 3D organı modelleri kanserini tedavi etmek ve toksikolojik çalışmaları yürütmek için yeni sitostatik ilaçlar geliştirebilmek için umut verici araçları temsil etmektedir. uzun vadede, yapay karaciğerler nakli gibi rejeneratif tıpta kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, 3D karaciğer modeli enfeksiyon biyoloji uygulamaları ve biyomedikal araştırmanın diğer alanlarda geniş bir yelpazede sunuyor.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Bernd Krostitz for technical assistance, Radoslaw Kedzierski for initial contributions to the project, Erik Wade for proofreading and giving helpful comments, and Prof. Heike Walles for providing the bioreactor and sharing her valuable experience with organ decellularization. We are also thankful for funding of the project and publication by the Berlin University of Technology.
Materials
| Incubator | Fraunhofer | / | |
| Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
| Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
| O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
| Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
| Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
| Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
| Screw Cap | Duran | 2924013 | |
| Screw Cap | Duran | 2924008 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
| Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
| Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
| Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
| Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
| T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicillin/ streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15x15x5mm | Sakura | 4566 | |
| Biopsy punch 4mm | pfm medical | 48401 | |
| Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |
References
- Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes. Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).
- Butler, D., Callaway, E. Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal. Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).
- Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029 (2015).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).
- Wagner, A., et al. Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors. J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).
- Kay, M. A. State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).
- Yla-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard. Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).
- Takagi, H., et al. Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR. J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).
