Studio di vettori virali in un tridimensionale fegato Modello ripopolata con l'Umano carcinoma epatocellulare Linea cellulare HepG2

NOTA: RL ottenuto l'approvazione etica per l'espianto di organi dal Landesamt für Gesundheit und Soziales (LAGeSo). I fegati sono stati espiantati da ratti Wister. La vena cava inferiore e la vena porta del fegato sono stati cannulata con una cannula 22 G. Metodi per la decellularization di fegati espiantati sono stati descritti in precedenza. 4,5 Le matrici extracellulari usati qui sono stati ottenuti da eccessiva perfusione di fegato di ratto con desossicolato di sodio 1%. 1. Recellularization di matrice extracellulare (ECM) di un fegato di ratto Ampliamento della linea di cellule epatiche HepG2 Culture linea cellulare HepG2 carcinoma epatocellulare in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 10% di siero fetale di vitello, 2 mM glutammina, e 2 mM di penicillina e streptomicina, ogni. Seed 1.5 x 10 7 cellule in bottiglie T175 e crescere le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 </sub>. Celle di raccolta dopo 4 giorni di tripsinizzazione per 5 min a 37 ° C, 5% di CO 2. Centrifugare le cellule a 300 xg e risospendere in 4 ml di PBS e contare le cellule con una camera di Neubauer sotto un microscopio. Una bottiglia T175 produrrà circa 4,5 x 10 7 cellule. NOTA: Assicurarsi che la cultura contiene il numero di cellule sufficiente per Recellularization della ECM fegato di ratto con 6 x 10 8 cellule HepG2 per ECM (10 x 175 cm 2 fiasche di coltura con 4-5 x 10 8 cellule ciascuno). Figura 1. sistema di bioreattore. A) Questo sistema di bioreattore è stato realizzato su misura. Mantiene i modelli di organo a 37 ° C e 5% CO 2. Le portate delle pompe peristaltiche possono essere regolati singolarmente. B) Il fegato è posto in una camera di crescita e collegareed al circuito di perfusione, che consiste in una pompa peristaltica, un serbatoio di media, un gorgogliatore e un sensore di pressione. prego qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Recellularization della ECM Impostare il sistema di bioreattore, contenente una camera di perfusione del fegato, un sistema di perfusione, un serbatoio di media e un gorgogliatore. Sterilizzare il sistema di bioreattore (121 ° C, 15 min). Collegare il sistema bioreattore con una pompa peristaltica e collocarlo in una incubatrice prevedendo condizioni adeguate (37 ° C, 5% CO 2). Posizionare decellularized scaffold fegato di ratto 8 nella camera di perfusione del fegato del sistema bioreattore (Figura 1). Collegare la vena porta cannulato e vena cava con clip tubo al sistema di perfusione. Equilibrare scaffold con 150 ml di RPMI medio (come descritto in 1.1)oltre 5 d con una portata di 1,25 ml / min. Scollegare il ponteggio fegato dal circuito media e inoculare il ponteggio con 3 x 10 8 cellule HepG2 (in 5 ml) attraverso la vena porta utilizzando una siringa da 5 ml, evitando la formazione di bolle d'aria e consentire alle cellule di ripopolare ECM incubandoli per 1 hr nel scaffold con la pompa spenta. Aumentare gradualmente la portata regolando la pompa, a partire da 1,25 ml / min per 10 min; 2,5 ml / min per 20 min e infine 3.75 ml / min per 30 min. Ripetere i punti 1.2.4-1.2.5 per raggiungere un numero di cellule totale di 6 x 10 8. Eseguire il sistema bioreattore ad una portata di 3,75 ml / min. Cultura del fegato di ratto recellularized per 2 settimane. NOTA: Sostituire un terzo del mezzo con terreno fresco (50 ml) a giorni alterni. Campione mezzo di coltura per rilevare parametri fisiologici, come l'attività di lattato deidrogenasi, il pH dei campioni medi e la concentrazione di glucosio e lattato. 2. La trasduzione del Recellularized fegato di ratto Produzione su larga scala di AAV vettori Produrre, purificare, e quantificare vettori AAV come descritto in precedenza: 11 In breve, la produzione di vettori AAV in bottiglie a rulli e purificare da iodixanolo gradiente di centrifugazione. Rimuovere iodixanolo residua mediante filtrazione su PD10 colonne di filtrazione di gel. Determinare la concentrazione AAV vettore per qPCR utilizzando DNA genomico AAV come standard. NOTA: L'auto-complementare, pseudotyped AAV2 / 6 vettore utilizzato in questo studio codificato EmGFP come reporter per dimostrare l'efficienza di trasduzione e di una cassetta di espressione shRNA per l'atterramento di un gene endogeno espresso (cyclophilin umano B (hCycB), figura 2) . Garantire una quantità sufficiente di vettori scAAV pseudotyped di sierotipo 6 (2,7 x 10 13 AAV vettori per modello del fegato). Figura 2. Mappa del auto-complementari, pseudotyped AAV2 / 6 vettore utilizzato nel presente studio. Il genoma consiste delle ripetizioni terminali invertite (ITR) di AAV2 e codifica EmGFP sotto controllo del promotore CMV e un shRNA sotto controllo di un promotore U6. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. La trasduzione del fegato Modello Regolare la soluzione AAV vettoriale in una concentrazione finale di 2,7 x 10 13 genomi vettoriali in 5 ml aggiungendo il rispettivo volume di PBS. Scollegare il fegato dal circuito supporti rimuovendo il tubo dalla cannula. Collegare una siringa da 5 ml alla cannula della vena porta e iniettare la soluzione AAV vector completa (5 ml). NOTA: Optionally, aggiungere rosso fenolo (5 mg / ml) per seguire la distribuzione della soluzione AAV vector tutto il fegato. Incubare per 1 ora, senza pompaggio. Aumentare gradualmente portata, iniziando con 1,25 ml / min per 10 min; 2,5 ml / min per 20 min e 3,75 ml / min per 30 min. Cultura del fegato di ratto recellularized oltre 6 giorni. Nota: sostituire un terzo della media come indicato nella nota sotto 1.2.7 3. Valutazione del Fegato Recellularized trasdotte Rat Ematossilina e eosina (HE) colorazione e analisi immunoistochimica Prendere campioni (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) da ciascun lobo epatico utilizzando un bisturi. Incubare campioni (da 3.1.1) in 4% paraformaldeide (PFA) + soluzione di saccarosio 4% per 1,5 ore a 4 ° C. (Attenzione: PFA è tossico e cancerogeno Tenere sempre PFA all'interno di una cappa aspirante e indossare indumenti di protezione adeguati..) Lavare tre volte con PBS (1 min per la fase di lavaggio) e incubare a 8%durante la notte di saccarosio a 4 ° C. Versare il fissaggio di media in cryomolds plastica, posizionare i campioni in fissaggio mezzo privo di bolle d'aria. Aggiungere mezzo di fissaggio fino campione è ben coperto. Conservare i campioni incorporato a -80 ° C fino a nuovo uso. Preparare crio-sezioni (10 micron) con una cryotome 12. Valutare Recellularization da ematossilina eosina + 8. Valutare l'efficienza di trasduzione dalla colorazione immunoistochimica per l'interesse gene-di-(qui: EmGFP). prelievo di campioni biologici molecolare Campione ciascun lobo fegato con un punzone biopsia (4 mm di diametro). Isolare RNA totale, DNA e proteine in base alle istruzioni del produttore per la valutazione di espressione del transgene di EmGFP, e hCycB abbattere 8.