La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

El diagnóstico prenatal es una importante herramienta clínica para evaluar enfermedades genéticas (es decir, aberraciones cromosómicas, enfermedades monogénicas o poligenéticos / multifactorial) y malformaciones congénitas (hernia diafragmática congénita es decir, lesiones pulmonares quísticas, onfalocele, gastrosquisis). El líquido amniótico (AF) las células son fáciles de obtener de forma rutinaria los procedimientos programados durante el segundo trimestre del embarazo (es decir, la amniocentesis y amniorreducción) o cesáreas ^{1, 2.} La disponibilidad de las células AF de pacientes prenatales o neonatales ofrece la posibilidad de utilizar esta fuente para la medicina regenerativa, y varios investigadores investigó la posibilidad de tratar diferentes daños de tejidos o enfermedades utilizando una población de células madre aisladas de AF ^{3, 4, 5, 6}, ^{7, 8, 9, 10, 11, 12.} La posibilidad de obtener fácilmente células AF de pacientes enfermos, en una ventana de tiempo en el que la enfermedad es a menudo estacionario, abre el camino a la idea de utilizar esta fuente de células para los propósitos de reprogramación. De hecho, las células madre pluripotentes inducidas (iPS) derivadas de células AF podrían diferenciarse en las células de interés para las pruebas de fármacos in vitro o para los enfoques de ingeniería de tejidos, con el fin de preparar una terapia adecuada específica del paciente antes del parto. Muchos estudios ya han demostrado la capacidad de las células AF para ser reprogramado y diferenciarse en una amplia gama de tipos de células ^{13, 14, 15, 16, 17 <}/ ^{sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.}

Desde el descubrimiento por Takahashi y Yamanaka ²⁸ de células somáticas reprogramadas a través de la expresión forzada de cuatro factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y CMYC), se han hecho progresos en el campo de la reprogramación. Teniendo en cuenta los diferentes métodos, podemos distinguir entre los enfoques virales y no virales. La primera espera que el uso de vectores virales (retrovirus y lentivirus), que tienen una alta eficiencia, pero silenciamiento generalmente incompleta del transgén retroviral, tanto con la consecuencia de una línea de células parcialmente reprogramado y el riesgo demutagénesis por inserción ^{29, 30, 31.} El método no viral utiliza diferentes estrategias: es decir, plásmidos, vectores, ARNm, proteínas, transposones. La derivación de células iPS libres de secuencias transgénicas pretende eludir los efectos potencialmente nocivos de la expresión del transgen con fugas y la mutagénesis por inserción. Entre todas las estrategias no virales mencionados anteriormente, el sistema de transposón / transposasa PiggyBac (PB) requiere sólo las repeticiones terminales invertidas que flanquean un transgén y la expresión transitoria de la enzima transposasa para catalizar eventos de inserción o de escisión ^32. La ventaja en el uso de transposones sobre otros métodos para la generación de células iPS es la posibilidad de obtener células iPS libre de vectores con un enfoque de vector no viral que muestra la misma eficacia de los vectores retrovirales. Esto es posible mediante escisión trace-menos de la codificación transposón integrado para la reprogramming siguientes factores de una nueva expresión transitoria de la transposasa en las células iPS ^33. Dado que PB es eficiente en diferentes tipos de células ^{34, 35, 36, 37,} es más adecuado para un enfoque clínico con respecto a los vectores virales, y permite la producción de células iPS sin xeno contrario a protocolos de producción virales actuales que utilizan xenobiótico condiciones, este sistema se utiliza para obtener células iPS a partir murino AF.

Aquí proponemos un protocolo detallado siguientes trabajos ya publicados para mostrar la producción de iPS a partir de células pluripotentes clones AF de ratón (células iPS-AF) ^38.