De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

Prenatale diagnostiek is een belangrijk klinisch hulpmiddel om genetische ziekten (dwz chromosomale afwijkingen, monogenetische of polygenetische / multifactoriële aandoeningen) en aangeboren afwijkingen (dwz hernia diafragmatica, cystic long laesies, exomphalos, gastroschisis) te evalueren. Vruchtwater (AF) cellen zijn eenvoudig te verkrijgen van routinematig geplande procedures tijdens het tweede trimester van de zwangerschap (dwz vruchtwaterpunctie en amnioreduction) of keizersneden ^{1, 2.} De beschikbaarheid van AF cellen van prenatale en neonatale patiënten geeft de mogelijkheid om deze bron regeneratieve medicijnen en verscheidene onderzoekers onderzochten de mogelijkheid om verschillende weefselbeschadigingen of ziekten met een stamcelpopulatie geïsoleerd uit AF ^{3, 4, 5, 6} behandel, ^{7, 8, 9, 10, 11, 12.} Zich gemakkelijk verkrijgen AF cellen van zieke patiënten in een tijdvenster waarin de ziekte is vaak stilstaat, opent de weg naar het idee van deze cel bron voor herprogrammering doeleinden. Inderdaad zou geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen afkomstig van AF cellen worden gedifferentieerd in de cellen van belang in vitro drug tests of weefselengineering, teneinde een adequate patiënt-specifieke therapie bereiden voor de bevalling. Vele studies hebben reeds werd aangetoond dat AF cellen te herprogrammeren en onderverdeeld in een groot aantal celtypes ^{13, 14, 15, 16, 17 <}/ ^{sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.}

Sinds de ontdekking van Takahashi en Yamanaka ²⁸ van reprogrammed somatische cellen door de geforceerde expressie van vier transcriptiefactoren (Oct4, Sox2, cMYC en Klf4), is er vooruitgang geboekt op het gebied van de herprogrammering. Gezien de verschillende werkwijzen kunnen onderscheiden tussen virale en niet-virale benaderingen. De eerste verwacht dat het gebruik van virale vectoren (retrovirussen en lentivirussen), die een hoge efficiëntie, maar meestal onvolledige onderdrukking van de retrovirale transgen met zowel het gevolg van een gedeeltelijk geherprogrammeerd cellijn en het risico van zijninsertiemutagenese ^{29, 30, 31.} De niet-virale werkwijze gebruikt verschillende strategieën: bijvoorbeeld plasmiden, vectoren, mRNA, eiwit, transposons. De afleiding van iPS-cellen vrij van transgene sequenties heeft tot doel de mogelijke schadelijke effecten van lekkende transgenexpressie en insertiemutagenese omzeilen. Van alle hierboven vermelde niet-virale strategie, de piggyBac (PB) transposon / transposase vereist alleen de omgekeerde terminale herhalingen flankeren een transgen en tijdelijke expressie van het transposase enzym katalyseren invoeging of excisie gebeurtenissen ^32. Het voordeel bij het gebruik van transposons boven andere werkwijzen voor iPS celgeneratie is de mogelijkheid om vectorvrije iPS cellen met een niet-virale vector benadering dezelfde efficiëntie van retrovirale vectoren toont. Dit kan door trace-less excisie van het transposon geïntegreerde codering voor de reprogramming factoren naar aanleiding van een nieuwe tijdelijke expressie van de transposase in de iPS-cellen ^33. Aangezien PB efficiënt in verschillende celtypes ^{34, 35, 36, 37,} is meer geschikt voor een klinische benadering met betrekking tot virale vectoren, en maakt de productie van xeno-vrije iPS cellen strijd met de huidige virusproductie protocollen die xenobiotische gebruiken voorwaarden, wordt dit systeem gebruikt om iPS cellen te verkrijgen uit muizen AF.

Hier stellen we een gedetailleerd protocol volgende reeds gepubliceerde werk om de productie van pluripotente iPS klonen van muizen AF-cellen (iPS-AF-cellen) ³⁸ te tonen.