La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni

La diagnosi prenatale è un importante strumento clinico per valutare le malattie genetiche (cioè aberrazioni cromosomiche, malattie monogeniche o poligeniche / multifattoriale) e malformazioni congenite (cioè ernia diaframmatica congenita, lesioni polmonari cistiche, onfalocele, gastroschisi). Il liquido amniotico (AF), le cellule sono semplici da ottenere dalle procedure di routine in programma durante il secondo trimestre di gravidanza (cioè l'amniocentesi e amnioreduction) o parti cesarei ^{1, 2.} La disponibilità di cellule da pazienti AF prenatale o neonatale fornisce la possibilità di utilizzare questa fonte per la medicina rigenerativa, e diversi ricercatori studiato la possibilità di trattare diversi danni tissutali o malattie utilizzando una popolazione di cellule staminali isolate da AF ^{3, 4, 5, 6}, ^{7, 8, 9, 10, 11, 12.} La possibilità di ottenere facilmente cellule AF di pazienti malati, in una finestra temporale in cui la malattia è spesso stazionario, apre la strada per l'idea di utilizzare questa fonte di cellule per scopi di riprogrammazione. Infatti, staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule derivate da cellule AF potrebbero essere differenziate nelle cellule di interesse per i test in vitro di droga o per gli approcci di ingegneria dei tessuti, al fine di preparare una adeguata terapia specifica per il paziente prima del parto. Molti studi hanno già dimostrato la capacità delle cellule AF da riprogrammare e differenziato in una vasta gamma di tipi di cellule ^{13, 14, 15, 16, 17 <}/ ^{sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.}

Dal momento che la scoperta da Takahashi e Yamanaka ²⁸ di riprogrammazione delle cellule somatiche attraverso l'espressione forzata di quattro fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, cMyc e Klf4), sono stati compiuti progressi nel campo della riprogrammazione. Considerando i diversi metodi, possiamo distinguere tra approcci virali e non virali. Il primo si aspetta l'utilizzo di vettori virali (retrovirus e lentivirus), che hanno elevata efficienza, ma silenziamento solito incompleta del transgene retrovirale, sia con la conseguenza di una linea cellulare parzialmente riprogrammato e il rischio diinserzionale mutagenesi ^{29, 30, 31.} Il metodo non virale utilizza diverse strategie: cioè plasmidi, vettori, mRNA, proteine, trasposoni. La derivazione di cellule iPS liberi di sequenze transgeniche ha lo scopo di aggirare gli effetti potenzialmente nocivi di espressione del transgene che perde e mutagenesi inserzionale. Tra tutte le strategie non virali di cui sopra, il piggyBac (PB) Sistema di trasposoni / trasposasi richiede solo le ripetizioni terminali invertite che fiancheggiano un transgene ed espressione transitoria dell'enzima trasposasi di catalizzare l'inserimento o escissione eventi ^32. Il vantaggio nell'uso trasposoni rispetto ad altri metodi per la generazione di cellule iPS è la possibilità di ottenere cellule iPS privo di vettore con un approccio vettore non virale che mostra la stessa efficienza di vettori retrovirali. Ciò è possibile mediante escissione traccia meno della codifica trasposone integrato per la reprogramming fattori a seguito di una nuova espressione transitoria del trasposasi nelle cellule iPS ^33. Dato che PB è efficiente in diversi tipi cellulari ^{34, 35, 36, 37,} è più adatto per un approccio clinico rispetto ai vettori virali, e consente la produzione di cellule iPS libera-xeno contrariamente a protocolli di produzione virali correnti che utilizzano xenobiotico condizioni, questo sistema viene utilizzato per ottenere cellule iPS da murino AF.

Di seguito vi proponiamo un protocollo dettagliato seguenti lavori già pubblicati per mostrare la produzione di iPS pluripotenti cloni di cellule di topo AF (cellule iPS-AF) ^38.