Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы

Пренатальная диагностика является важным клиническим инструментом для оценки генетических заболеваний (т.е. хромосомных аберраций, моногенные или полигенных / многофакторный заболевания) и врожденные пороки развития (то есть врожденная диафрагмальная грыжа, кистозные поражения легких, пупочная грыжа, Гастрошизис). Амниотической жидкости (AF) клетки легко получить из регулярно запланированных процедур во втором триместре беременности (т.е. амниоцентеза и амниоредукцией) или кесарева сечения ^{1, 2.} Наличие клеток AF от пренатальной или неонатальных пациентов дает возможность использовать этот источник для регенеративной медицины, и некоторые исследователи исследовали возможность лечения различных повреждений тканей или болезни , используя популяцию стволовых клеток , выделенной из AF ^{3, 4, 5, 6}, ^{7, 8, 9, 10, 11, 12.} Возможность легко получать клетки AF от больных пациентов, в окне времени, в котором заболевание часто неподвижен, открывает путь к идее использования этого источника клеток для целей перепрограммирования. Действительно, индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клетки , полученные из клеток AF может быть дифференцирован в клетках , представляющих интерес для экстракорпорального тестирования на наркотики или для тканевой инженерии подходов, с тем чтобы подготовить адекватный пациент-специфической терапии до родов. Многие исследования уже продемонстрировали способность клеток AF перепрограммировать и дифференцировались в широком диапазоне типов клеток ^{13, 14, 15, 16, 17 <}/ ^{SUP>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.}

С момента открытия Такахаши и Яманака ²⁸ перепрограммирован соматических клеток через форсированной экспрессии четырех факторов транскрипции (Oct4, Sox2, CMYC и Klf4), прогресс был достигнут в области перепрограммирования. Рассматривая различные методы, мы можем различать вирусные и невирусных подходы. Первый предполагает использование вирусных векторов (ретровирусы и лентивирусов), которые имеют высокую эффективность, но, как правило, неполное глушение ретровирусного трансгена, причем как следствие частично перепрограммирован клеточной линии и рискинсерционного мутагенеза ^{29, 30, 31.} Невирусная метод использует различные стратегии: т.е. плазмиды, векторы, мРНК, белки, транспозонов. Вывод плюрипотентных клеток свободных трансгенных последовательностей стремится обойти потенциально вредные последствия вытекающей трансгенной экспрессии и инсерционного мутагенеза. Среди всех вышеперечисленных невирусных стратегий, то PiggyBac (PB) система транспозонов / транспозаза требует только перевернутые концевые повторы фланговые трансген и переходную экспрессию транспозазы фермента катализировать вставки или иссечения события ^32. Преимущество в использовании транспозонов по сравнению с другими методами для генерации иПК клеток является возможность получения вектора свободных плюрипотентных клеток с не вирусным вектором подход, который показывает ту же самую эффективность ретровирусных векторов. Это возможно с помощью трассировки менее иссечения интегрированной кодировки транспозонов для reprogramming факторы после новой временной экспрессии транспозаза в клетках плюрипотентных ^33. Учитывая , что ПБ является эффективным в различных типах клеток , ^{34, 35, 36, 37,} больше подходит для клинического подхода в отношении вирусных векторов, а также позволяет для производства Xeno свободных плюрипотентных клеток в отличие от текущих вирусных производства протоколы , которые используют ксенобиотика условия, эта система используется для получения плюрипотентных клеток из мышиного AF.

Здесь мы предлагаем подробный протокол следующую уже опубликованную работу , чтобы показать производство плюрипотентных плюрипотентных клонов из клеток AF мыши (плюрипотентных клеток-AF) ^38.