Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Eine vorgeburtliche Diagnostik ist ein wichtiges klinisches Werkzeug , um genetische Krankheiten zu bewerten (dh Chromosomenaberrationen, monogenetische oder polygenetische / multifaktoriellen Erkrankungen) und angeborene Fehlbildungen (zB Zwerchfellhernie, zystische Lungenläsionen, Exomphalos, gastroschisis). Nachwasser (AF) Zellen sind einfach von routinemäßig geplanten Prozeduren während des zweiten Trimesters der Schwangerschaft (dh Amniozentese und amnioreduction) oder Kaiserschnitte ^{1, 2} zu erhalten. Die Verfügbarkeit von AF – Zellen aus der pränatalen oder Neugeborenen Patienten bietet die Möglichkeit , diese Quelle für die regenerative Medizin und mehrere Forscher untersuchten die Möglichkeit , verschiedene Gewebeschäden oder Krankheiten zu behandeln , um eine Stammzellpopulation mit getrennt von AF ^{3, 4, 5, 6}, ^{7, 8, 9, 10, 11, 12.} Die Möglichkeit, leicht AF-Zellen aus erkrankten Patienten erhalten wird, in einem Zeitfenster, in dem die Krankheit oft stationär ist, öffnet den Weg für die Idee der Verwendung dieser Zellquelle für eine Neuprogrammierung Zwecke. Tatsächlich induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) aus AF – Zellen abgeleiteten Zellen könnten für in vitro Drogentests oder für das Tissue Engineering Ansätze in den Zellen von Interesse unterschieden werden, um eine ausreichende patientenspezifischen Therapie vor der Geburt vorzubereiten. Viele Studien haben bereits die Fähigkeit der AF – Zellen nachgewiesen , in einem weiten Bereich von Zelltypen ^{13, 14, 15, 16, 17} und umprogrammiert zu unterscheiden ^</ ^{sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.}

Seit der Entdeckung von Takahashi und Yamanaka ²⁸ reprogrammierter somatischen Zellen durch die erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren (Oct4, Sox2, cMyc und Klf4) wurden Fortschritte auf dem Gebiet der Reprogrammierung gemacht. die verschiedenen Methoden unter Berücksichtigung, können wir zwischen viralen und nicht-viralen Methoden unterscheiden. Die erste erwartet, dass die Verwendung von viralen Vektoren (Retroviren und Lentiviren), die einen hohen Wirkungsgrad besitzen, aber in der Regel unvollständige silencing des retroviralen Transgen, sowohl mit der Folge einer teilweise umprogrammiert Zelllinie und das Risiko vonInsertionsmutagenese ^{29, 30, 31.} Die nicht-virale Verfahren verwendet verschiedene Strategien: dh Plasmide, Vektoren, mRNA, Protein, Transposons. Die Ableitung von iPS-Zellen frei von transgenen Sequenzen zielt darauf ab, die potenziell schädlichen Auswirkungen von undichten Transgen-Expression und Insertionsmutagenese zu umgehen. Unter all den oben genannten nicht-viralen Strategien, die PiggyBac (PB) Transposon / Transposase System benötigt nur die invertierten terminalen Wiederholungen ein Transgen und eine transiente Expression der Transposase – Enzym flankieren ³² Insertion oder Exzision Ereignisse zu katalysieren. Der Vorteil in Transposons gegenüber anderen Verfahren für iPS Zellgeneration Verwendung ist die Möglichkeit des Erhalts vektorfreien iPS-Zellen mit einem nicht-viralen Vektor Ansatz, der die gleiche Effizienz von retroviralen Vektoren zeigt. Dies ist möglich durch die Spur-less Exzision des integrierten Transposons Codierung für die reprogramming Faktoren nach einer neuen transiente Expression der Transposase in den iPS – Zellen ^33. Da PB in verschiedenen Zelltypen effizient ^{34, 35, 36, 37,} ist besser geeignet für einen klinischen Ansatz bezüglich viraler Vektoren und erlaubt die Herstellung von xeno freien iPS – Zellen im Gegensatz zu derzeitigen Protokolle virale Produktion , die xenobiotischen verwenden Bedingungen wird dieses System verwendet iPS-Zellen aus Maus-AF zu erhalten.

Hier schlagen wir ein detailliertes Protokoll folgende bereits veröffentlichten Arbeiten die Herstellung von pluripotenten iPS – Klone zu zeigen , von der Maus AF – Zellen (iPS-AF – Zellen) ^38.