A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Diagnóstico pré-natal é uma importante ferramenta clínica para avaliar doenças genéticas (ou seja, aberrações cromossômicas, doenças monogenéticos ou poligenéticos / multifactorial) e malformações congênitas (hérnia diafragmática congênita ou seja, lesões pulmonares císticas, onfalocele, gastrosquise). As células do líquido amniótico (AF) são simples de se obter a partir de procedimentos de rotina programadas durante o segundo trimestre de gravidez (ou seja, a amniocentese e amnioreduction) ou cesarianas ^{1, 2.} A disponibilidade de células pré-natais de FA a partir de pacientes ou de neonatais proporciona a possibilidade de utilizar esta fonte para a medicina regenerativa, e vários investigadores investigaram a possibilidade de tratar diferentes doenças ou danos de tecidos utilizando uma população de células estaminais isolado a partir de AF ^{3, 4, 5, 6}, ^{7, 8, 9, 10, 11, 12.} A possibilidade de obter facilmente células AF de pacientes doentes, em uma janela de tempo em que a doença é muitas vezes parado, abre o caminho para a idéia de usar esta fonte de células para fins de reprogramação. Na verdade,-tronco pluripotentes induzidas (iPS células) derivadas de células AF poderia ser diferenciadas em células de interesse para testes in vitro de droga ou de abordagens de engenharia de tecidos, a fim de preparar uma terapia adequada e específica no paciente antes do parto. Muitos estudos já demonstraram a capacidade das células AF de ser reprogramado e diferenciadas em uma ampla gama de tipos de células ^{13, 14, 15, 16, 17 <}/ ^{sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.}

Desde a descoberta por Takahashi e Yamanaka ²⁸ de células somáticas reprogramadas através da expressão forçada de quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, cMyc e KLF4), os progressos têm sido feitos no campo da reprogramação. Considerando os diferentes métodos, pode-se distinguir entre as abordagens virais e não virais. A primeira espera que o uso de vectores virais (retrovírus e lentivírus), que têm alta eficiência, mas geralmente incompleta silenciamento do transgene retroviral, tanto com a consequência de uma linha de células parcialmente reprogramados e o risco deinserção mutagênese ^{29, 30, 31.} O método não-viral utiliza diferentes estratégias: isto é, plasmídeos, vectores, ARNm, proteína, transposões. A derivação de células iPS livres de sequências transgênicas visa contornar os efeitos potencialmente prejudiciais de expressão do transgene gotejante e mutagénese de inserção. Entre todos os mencionados estratégias não-virais acima, a piggyBac (PB) sistema de transposão / transposase requer apenas as repetições terminais invertidas flanqueiam um transgene e a expressão transiente da enzima transposase para catalisar a inserção ou excisão eventos ^32. A vantagem na utilização de transposões sobre outros métodos para a geração de células IPS é a possibilidade de obtenção de células iPS livre do vector com uma abordagem de vector não virai, que mostra a mesma eficiência de vectores retrovirais. Isto é possível por excisão-traço inferior da codificação de transposão integrada para a reprogramming factores na sequência de uma nova expressão transitória da transposase nas células iPS ^33. Dado que o OP é eficaz em diferentes tipos de células ^{34, 35, 36, 37,} é mais adequado para uma abordagem clínica no que diz respeito aos vectores virais, e permite a produção de células iPS livre de xeno contrariamente aos protocolos de produção virais correntes que usam xenobióticos condições, este sistema é usado para obter as células iPS a partir AF murino.

Aqui propomos um protocolo detalhado seguintes trabalhos já publicados para mostrar a produção de clones iPS pluripotentes a partir de células AF rato (células iPS-AF) ^38.