Антитело Этикетировочное с флуоресцентными красителями с использованием магнитных Protein A и G белка бусин

Антитела , меченные небольшими молекулами являются , пожалуй, наиболее часто используемые реагенты в биологии ^1,2. Антитела , меченные флуоресцентными красителями и биотин широко используются в визуализации, иммунологического анализа, проточной цитометрии, вестерн – блоттинга и иммунопреципитации среди других приложений ^3-6. Радиоактивно меченных ^3,7 находят широкое применение в визуализации и терапии, антител , меченных цитостатическими препаратами (АСДУ) предлагают новые возможности для лечения рака, и два АЦП уже одобрены для терапевтического применения ^8. Несмотря на широкое применение, методы для мечения антител остаются на удивление неизменными и обычно включают в себя несколько реакций и обессоливания шаги ^9-12. Методы решения работают очень хорошо в тех случаях, когда требуется помечать лишь несколько антител и доступны в высокоочищенной форме при высокой концентрации и в достаточных объемах. Тем не менее, для новых приложений, таких как АЦП, естьнеобходимо маркировать антитела на ранней стадии гибридом , так что они могут быть подвергнуты скринингу на биологически активные свойства, например, рецептор-опосредованный антителами интернализации ^13-16. На этапе гибридом, выборочные объемы ограничены, антитела экспрессируются в низких концентрациях, а также ряд образцов велики, следовательно, решение, основанное методы маркировки не подходят.

Чтобы упростить и улучшить пропускную способность традиционных методов маркировки антител, несколько альтернативных подходов были предложены ^17,18. Один из подходов состоит в использовании немагнитного белок сродства бусинки, упакованных в маленькие колонки для захвата антител с последующей реакцией с ярлыком и элюции меченого и очищенного белка. Этот метод может быть использован для обозначения антител непосредственно из клеточных сред, тем не менее, использование колонн может быть трудоемким. Метод , основанный магнитный шарик недавно сообщалось , что ¹⁹ исключает использование колонн и повышает пропускную способность, но из – зав ячейки антитела способность гранул, только нанограмм на низких микрограммных количеств антител, могут быть помечены.

Недавно мы разработали и использовали Высокая емкость магнитного белка А и белка G бусин (> 20 мг человеческого IgG / мл осевшие шарики) для обозначения антитела , присутствующие в клеточной среде с малыми молекулами ^20. Высокая емкость гранул позволяет десятков до сотен микрограммов антител помечать удобно и быстрое магнитный отклик гранул упрощает обработку и обработку большого числа образцов параллельно. Использование флуоресцентных красителей в качестве суррогата для малых молекул, мы покажем, что метод совместим с амином и тиоловой химии маркировки и предлагает высокое извлечение меченых и очень чистых антител.

Этот протокол и сопровождающий видео описывают по-бусинки мечение мышиных антител, присутствующих в средах клеток с использованием магнитных белка A и протеин G-бусинки. Протоколразделен на четыре секции: Секция 1 описывает захват антител на шарик из биологических образцов. После захвата, маркировка антител с флуоресцентным красителем с использованием амина или химии с использованием тиоловой химии описана в разделах 2 и 3 секции соответственно. Наконец, в разделе 4 описывается метод для расчета концентрации антител и красителя соотношение антител.