Antibody Labeling con tintes fluorescentes utilizando proteína magnética A y Proteína G cuentas

Anticuerpos marcados con moléculas pequeñas son, quizás, los reactivos usados ​​más comúnmente en biología ^1,2. Los anticuerpos marcados con colorantes fluorescentes y biotina se utilizan ampliamente en formación de imágenes, inmunoensayos, citometría de flujo, transferencias de Western, inmunoprecipitación y entre otras aplicaciones ^3-6. Los anticuerpos radiomarcados ^3,7 encuentran un amplio uso en formación de imágenes y terapia, anticuerpos marcados con fármacos citotóxicos (ADCs) están ofreciendo nuevas opciones para el tratamiento de cánceres, y dos ADC ya han sido aprobados para su uso terapéutico ^8. A pesar de su amplio uso, los métodos para marcar anticuerpos se han mantenido sorprendentemente sin cambios y por lo general involucran a múltiples reacciones y desalado pasos ^9-12. métodos de solución funcionan muy bien en los casos en que sólo unos pocos anticuerpos deben ser etiquetados y están disponibles en forma altamente purificada en una concentración elevada y en volúmenes suficientes. Sin embargo, para nuevas aplicaciones como ADCs, hay unatenga que marcar anticuerpos en la fase temprana de hibridoma para que puedan ser evaluados para propiedades biológicamente relevantes, por ejemplo, la internalización de anticuerpos mediada por receptores ^13-16. En la etapa de hibridoma, los volúmenes de muestra son limitados, los anticuerpos se expresan en concentraciones bajas y un número de muestras son grandes, por lo tanto, métodos de etiquetado a base de soluciones no son adecuados.

Para simplificar y mejorar el rendimiento de los métodos tradicionales de etiquetado de anticuerpos, algunos enfoques alternativos se han propuesto ^17,18. Un enfoque consiste en utilizar las proteínas no magnético A perlas de afinidad envasados ​​en pequeñas columnas para capturar anticuerpos seguido de la reacción de marcaje y la elución de la proteína marcada y purificada. Este método se puede utilizar para marcar anticuerpos directamente desde el soporte de células, sin embargo, el uso de columnas puede ser laborioso. Un método basado perla magnética Recientemente se ha informado ¹⁹ que elimina el uso de columnas y mejora el rendimiento pero debidoa la capacidad de las perlas de la unión del anticuerpo limitado, solamente nanogramo a cantidades de microgramos bajos de los anticuerpos podría ser etiquetado.

Recientemente hemos desarrollado y utilizado de alta capacidad magnética Proteína A y Proteína G cuentas (> 20 mg de IgG humana / ml de perlas sedentarios) para etiquetar los anticuerpos presentes en los medios de comunicación celular con moléculas pequeñas ^20. La alta capacidad de las perlas permite decenas a cientos de microgramos de anticuerpo a ser etiquetados convenientemente y la respuesta magnética rápida de las perlas simplifica el manejo y procesamiento de un gran número de muestras en paralelo. El uso de colorantes fluorescentes como sustitutos de moléculas pequeñas, se muestra que el método es compatible con amina y tiol química etiquetado y ofrece altas recuperaciones de anticuerpos marcados y muy puros.

Este protocolo y el video que lo acompaña describen etiquetado en cordón de anticuerpos de ratón presentes en los medios de células utilizando cuentas de Proteína G magnética A y proteína. El protocolo esdividida en cuatro secciones: Sección 1 describe la captura de anticuerpos en la perla a partir de muestras biológicas. Después de la captura, el etiquetado de los anticuerpos con colorante fluorescente usando química de amina o tiol usando química se describe en las secciones 2 y la sección 3, respectivamente. Finalmente, la sección 4 se describe el método para el cálculo de la concentración de anticuerpos y el colorante a la proporción de anticuerpos.