Antikörpermarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen unter Verwendung von magnetischen Protein A und Protein G-Kügelchen

Antikörper , markiert mit kleinen Molekülen sind vielleicht die am häufigsten verwendeten Reagenzien in der Biologie ^1,2. Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte und Biotin werden in großem Umfang in der Bildgebung, Immunoassays, Durchflusszytometrie, Western – Blots und Immunpräzipitation unter anderen Anwendungen ^3-6. Radioaktiv markierte Antikörper ^3,7 finden umfangreiche Verwendung in der Bildgebung und Therapie, markierte Antikörper mit Zytostatika (ADCs) bieten neue Möglichkeiten für die Behandlung von Krebs und zwei ADCs wurden bereits für den therapeutischen Einsatz ⁸ genehmigt. Trotz einer umfassenden Nutzung haben sich die Verfahren zur Markierung von Antikörpern blieb überraschenderweise unverändert und beinhalten typischerweise mehrere Reaktionen und Entsalzung Schritte ^9-12. Lösungsmethoden arbeiten sehr gut in Fällen, in denen nur wenige Antikörper müssen gekennzeichnet werden und in gereinigter Form zur Verfügung stehen hoch in hoher Konzentration und in ausreichender Menge. Jedoch für neuere Anwendungen wie ADCs gibt es einAntikörper müssen in der frühen Stufe Hybridom zu etikettieren , so dass sie für biologisch relevante Eigenschaften gescreent werden, beispielsweise rezeptorvermittelte Internalisierung Antikörper ^13-16. Bei dem Hybridom Stadium sind Probenvolumina begrenzt, Antikörper werden in niedrigen Konzentrationen exprimiert und eine Anzahl von Proben sind groß, daher Lösung auf Basis Markierungsmethoden sind nicht geeignet.

Zur Vereinfachung und den Durchsatz der traditionellen Antikörpermarkierung Methoden zu verbessern, einige alternative Ansätze wurden ^17,18 vorgeschlagen. Ein Ansatz ist es nicht magnetischen Protein-A-Affinitätskügelchen in kleine Säulen gepackt zu verwenden, um Antikörper, gefolgt von der Markierungsreaktion und Elution von markiertem und gereinigtem Protein erfassen. Dieses Verfahren verwendet werden, die Antikörper direkt aus Zellmedien zu beschriften, jedoch kann die Verwendung von Säulen umständlich sein. Ein magnetisches bead basierte Methode wurde kürzlich berichtet worden , ¹⁹ daß die Verwendung von Spalten eliminiert und verbessert den Durchsatz , aber wegender begrenzten Antikörperkapazität der Beads Bindung nur Nanogramm bis niedrigen Mikrogramm-Mengen der Antikörper markiert werden.

Wir haben vor kurzem entwickelt und verwendet hoher Kapazität magnetischen Protein A und Protein G – Kügelchen (> 20 mg Human – IgG / ml des abgesetzten Kügelchen) ²⁰ – Antikörpern in Zellmedien mit kleinen Molekülen zu markieren. Die hohe Kapazität der Kügelchen ermöglicht zehn bis hundert Mikrogramm Antikörper bequem gekennzeichnet werden und die schnelle magnetische Reaktion der Kügelchen vereinfacht die Handhabung und Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben in parallel. Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen als Surrogate für kleine Moleküle zeigen wir, dass das Verfahren mit dem Amin und Thiol Markierungschemie kompatibel und bietet eine hohe Gewinnungsraten von markierten und sehr reine Antikörper.

Dieses Protokoll und die zugehörigen Video beschreiben On-Bead-Kennzeichnung von Maus-Antikörper, die in den Zellmedien Magnetic Protein A und Protein G-Kügelchen verwendet wird. Das Protokoll istgliedert sich in vier Abschnitte: Abschnitt 1 beschreibt die Erfassung von Antikörpern auf den Wulst aus biologischen Proben. Nach Erfassung der Markierung von Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoff Aminchemie oder Thiolchemie verwendet, ist in den Abschnitten 2 und Abschnitt 3 beschrieben sind. Schließlich Abschnitt 4 beschreibt das Verfahren zur Berechnung der Antikörperkonzentration und der Farbstoff-Antikörper-Verhältnis.