Anticorps marquage avec des colorants fluorescents en utilisant une protéine magnétique A et protéine G Perles

Des anticorps marqués avec de petites molécules sont peut – être les réactifs les plus couramment utilisés en biologie ^1,2. Des anticorps marqués avec des colorants fluorescents et la biotine sont largement utilisés dans l' imagerie, les dosages immunologiques, cytométrie en flux, des transferts Western, immunoprécipitation et parmi d' autres applications ^3-6. Anticorps radiomarqués ^3,7- trouvent une utilisation extensive dans l' imagerie et la thérapie, des anticorps marqués avec des médicaments cytotoxiques (ADC) sont offrant de nouvelles options pour le traitement des cancers, et deux ADCs ont déjà été approuvés pour une utilisation thérapeutique ^8. En dépit de leur large utilisation, les méthodes d'anticorps étiquetage sont restés étonnamment inchangé et généralement impliquer de multiples réactions et de dessalage étapes ^9-12. Méthodes de résolution fonctionnent très bien dans les cas où seuls quelques anticorps doivent être étiquetés et sont disponibles sous une forme hautement purifiée à forte concentration et en quantité suffisante. Cependant, pour les applications plus récentes comme ADCs, il y a unbesoin d'étiqueter des anticorps au stade précoce d'hybridome de sorte qu'ils peuvent être criblés pour des propriétés biologiques pertinents, par exemple, médiée par un récepteur d' anticorps intériorisation ^13-16. Au stade de l'hybridome, des volumes d'échantillons sont limités, les anticorps sont exprimés à de faibles concentrations et un certain nombre d'échantillons sont grandes, donc des méthodes d'étiquetage basées sur des solutions ne sont pas adaptés.

Pour simplifier et améliorer le débit des méthodes de marquage des anticorps traditionnels, quelques approches alternatives ont été proposées ^17,18. Une approche consiste à utiliser la protéine amagnétique A billes d'affinité emballés dans de petites colonnes pour capturer des anticorps suivie par la réaction de marquage et l'élution de la protéine marquée et purifiée. Cette méthode peut être utilisée pour marquer les anticorps directement à partir de milieux cellulaires, cependant, l'utilisation de colonnes peut être laborieuse. Un procédé basé sur des billes magnétiques a été récemment rapporté ¹⁹ qui élimine l'utilisation de colonnes et de débit mais à cause amélioreà l'anticorps capacité limitée des billes de liaison, seulement nanogramme à des quantités faibles de microgramme des anticorps pourrait être étiqueté.

Nous avons récemment développé et utilisé une grande capacité magnétique protéine A et protéine G perles (> 20 mg d'IgG / ml de perles sédentaires humain) pour étiqueter des anticorps présents dans les milieux de cellules avec de petites molécules ^20. La capacité élevée des bourrelets permet de dizaines à des centaines de microgrammes d'anticorps à marquer facilement et rapidement la réponse magnétique des billes simplifie la manipulation et le traitement d'un grand nombre d'échantillons en parallèle. En utilisant des colorants fluorescents comme substituts pour les petites molécules, nous montrons que la méthode est compatible avec amine et thiol étiquetage chimie et offre des recouvrements élevés d'anticorps marqués et très purs.

Ce protocole et la vidéo qui l'accompagne décrivent l'étiquetage sur cordon de anticorps de souris présents dans les médias de cellules en utilisant la protéine magnétique A et protéine G perles. Le protocole estdivisé en quatre sections: Section 1 décrit la capture d'anticorps sur le cordon à partir d'échantillons biologiques. Après la capture, le marquage des anticorps avec un colorant fluorescent à l'aide de la chimie amine ou en utilisant la chimie thiol est décrite dans les sections 2 et l'article 3, respectivement. Enfin, la section 4 décrit la méthode pour le calcul de la concentration d'anticorps et le colorant au rapport de l'anticorps.