תיוג נוגדן עם צבעי ניאון באמצעות חלבון מגנטי חלבון G חרוזים
Summary
השיטה על-חרוז תיוג נוגדנים עם מולקולות קטנות מאפשרת סימון של כמות קטנה של נוגדנים ישירות תקשורת תא. שיטה זו תואמת אמין וכימית תיאול, ואת יכולה להתמודד עם דגימות מרובות במקביל, באופן ידני או באמצעות פלטפורמות אוטומטיות.
Abstract
נוגדנים שכותרתו עם מולקולות קטנות כמו צבעי ניאון, תרופות ציטוטוקסיות קליעים נותבים רדיואקטיביים הם כלים חיוניים במחקר ביו, immunodiagnostics ולאחרונה כסוכנים טיפוליים. שיטות מסורתיות נוגדני תיוג עם מולקולות קטנות דורשות מטוהרי נוגדנים בריכוז גבוה יחסית, כרוכות צעדי דיאליזה מרובות מוגבלות תפוקה. עם זאת, מספר יישומים, כוללים בתחום הנוגדן ותרופות conjugates (ADC), ייהנו שיטות חדשות שתאפשרנה תיוג של נוגדנים ישירות תקשורת תא. שיטות אלה עשויות לאפשר נוגדנים שיוקרו מבחנים רלוונטיים מבחינה ביולוגית, למשל, assay הפנמת נוגדן קולטן בתיווך במקרה של ממירי ADC. כאן, אנו מתארים שיטה (על-חרוז) שיטה המאפשרת תיוג של כמויות קטנות של נוגדנים ישירות תקשורת תא. גישה זו משתמשת חלבון מגנטי קיבולת גבוהה חלבון זיקת G חרוז ללכוד נוגדניםמתקשורת התא ואחריו תיוג עם מולקולות קטנות או באמצעות אמין או כימית תיאול ו elution הבאה של הנוגדנים שכותרתו. אם ניקח צבעי ניאון כמו תחליפים עבור מולקולות קטנות, אנחנו מדגימים את התוויות על-חרוז של שלושה נוגדנים שונים עכבר ישירות מהמדיה תא באמצעות שני אמין וכימית תיוג תיאול. הזיקה מחייבת נוגדנים הגבוהה לחלבון וחלבון G מבטיחה החלמה גבוהה, כמו גם טוהר גבוה של הנוגדנים שכותרתו. בנוסף, שימוש חרוז מגנטיים מאפשר דגימות מרובות כדי להיות מטופלים באופן ידני, ובכך לשפר את תפוקת תיוג משמעותי.
Introduction
נוגדנים שכותרתו עם מולקולות קטנות הם אולי ריאגנטים הנפוצים ביותר 1,2 ביולוגיה. נוגדנים שכותרתו עם צבעי ניאון ו ביוטין נמצאים בשימוש נרחב בתחום ההדמיה, immunoassays, cytometry זרימה, כתמים מערביים, ו immunoprecipitation בין יישומים אחרים 3-6. נוגדני radiolabeled 3,7 למצוא שימוש נרחב בתחום הדמית טיפול, נוגדנים שכותרתו עם תרופות ציטוטוקסיות (ADC) מציעים אפשרויות חדשות לטיפול הסרטן, ושני ממירים ADC שכבר אושרו לשימוש טיפולי 8. למרות השימוש הנרחב שלהם, שיטות נוגדני תיוג נותרו ללא שינוי מפתיע ובדרך כלל כרוכות תגובות מרובות desalting שלבי 9-12. שיטות פתרון היטב לשימוש במקרים בם רק כמה נוגדנים צריכים להיות מתויגים והם זמינים בצורה נקיה במיוחד בריכוז גבוה בהיקפי מספיק. עם זאת, עבור יישומים חדשים יותר כמו ממירי ADC, קייםצריך לתייג נוגדנים בשלב hybridoma מוקדם כדי שיוכלו להיות מוקרן על תכונות רלוונטיות מבחינה ביולוגית, למשל, 13-16 הפנמת נוגדן קולטן בתיווך. בשלב hybridoma, כרכי מדגם מוגבלים, הנוגדנים באים לידי ביטוי בריכוזים נמוכים ומספר דגימות גדולות, ומכאן שיטות תיוג מבוסס פתרון אינן מתאימות.
כדי לפשט ולשפר את התפוקה של שיטות תיוג נוגדן המסורתיות, כמה גישות חלופיות הוצעו 17,18. גישה אחת היא להשתמש חלבון שאינו מגנטי חרוזים זיקה ארוזים עמודים קטנים ללכוד נוגדנים ואחריו התגובה תיוג ו elution של חלבון הנקרא וטיהר. שיטה זו יכולה לשמש כדי לתייג נוגדנים ישירות תקשורת תא, לעומת זאת, השימוש בעמודים יכול להיות מייגע. שיטה מגנטית חרוז מבוססת לאחרונה דווחה 19 זה מבטל את השימוש בעמודים משפר את התפוקה אך בשלכדי הנוגדן המוגבל יכולת קשירה של החרוזים, רק ננוגרם לכמויות מיקרוגרם נמוכים של הנוגדנים יכול להיות מתויג.
פתחנו לאחרונה והשתמשנו קיבולת גבוהה חלבון מגנטי חלבון G חרוזים (> 20 מ"ג של IgG אדם / מיליליטר של חרוזים מיושבים) לתייג נוגדנים נוכחיים בתקשורת תא עם מולקולות קטנות 20. הקיבולת הגבוהה של החרוזים מאפשרת עשרות עד מאה מיקרוגרם של נוגדנים להיות מתויגות בנוחות התגובה המגנטית המהירה של חרוזי מפשט טיפול ועיבוד של מספר רב של דגימות במקבילות. באמצעות צבעי ניאון כמו התחליפים עבור מולקולות קטנות, אנו מראים כי השיטה תואמת כימיה תיוג אמין ו תיאול ומציע החלמה גבוה של נוגדנים שכותרתו מאוד טהור.
פרוטוקול זה ואת הסרטון מלווה לתאר תיוג על-חרוז של נוגדני העכבר נוכחיים בתקשורת התא באמצעות חלבון מגנט חלבון G חרוזים. הפרוטוקול הואלארבעה חלקים מחולקים: סעיף 1 מתאר את לכידתו של נוגדנים על החרוז מ דגימות ביולוגיות. בעקבות לכיד, התיוג של נוגדנים עם צבע פלואורסצנטי באמצעות כימיה אמינה או באמצעות כימית תיאול מתואר בסעיפים 2 וסעיף 3, בהתאמה. לבסוף, סעיף 4 מתאר את השיטה לצורך החישוב של ריכוז נוגדנים ואת צבע יחס נוגדן.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח שיטה לתייג נוגדנים, נוכח בתקשורת התא בריכוזים נמוכים, עם מגוון רחב של מולקולות קטנות. שיטה כזו תאפשר מספר רב של נוגדנים, בשלבים הראשונים של גילוי נוגדנים, כדי להיות מתויגת עם מולקולות קטנות, ובדרך הוקרנה באמצעות assay רלוונטית מבחינה ביולוג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
References
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
- Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
- Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
- Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
- Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
- Kraeber-Bodere, F., et al. Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer. Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).
- Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
- Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , 380-382 (1996).
- Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
- Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
- Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
- Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708 (2015).
- Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
- Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
- Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
- Strachan, E., et al. Solid-phase biotinylation of antibodies. J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).
- Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
- Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
- Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
- Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7 (2004).
- Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
- Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).
