Anticorpo etichettatura con coloranti fluorescenti utilizzando proteine magnetica A e proteine G perline
Summary
Il metodo on-tallone per etichettare anticorpi con piccole molecole permette l'etichettatura di una piccola quantità di anticorpi direttamente dal supporto cellulare. Questo metodo è compatibile con ammina e chimica tiolo, e può gestire campioni multipli in parallelo, manualmente o utilizzando piattaforme automatizzate.
Abstract
Anticorpi marcati con piccole molecole come coloranti fluorescenti, farmaci citotossici, e traccianti radioattivi sono strumenti essenziali nella ricerca biomedica, immunodiagnostica e più recentemente come agenti terapeutici. I metodi tradizionali per gli anticorpi di etichettatura con piccole molecole richiedono anticorpi purificati in concentrazione relativamente alta, coinvolgono più passaggi dialisi ed hanno limitato il throughput. Tuttavia, diverse applicazioni, tra cui il campo di anticorpi coniugati farmaco (ADC), potranno beneficiare di nuovi metodi che consentano l'etichettatura di anticorpi direttamente dal supporto di cellule. Tali metodi possono consentire anticorpi proiettati in saggi biologicamente rilevanti, ad esempio, il dosaggio degli anticorpi internalizzazione mediata da recettori nel caso di ADC. Qui, descriviamo un (metodo on-tallone) metodo che consente l'etichettatura di piccole quantità di anticorpi direttamente dal supporto di cellule. Questo approccio utilizza ad alta capacità magnetica proteina A e la proteina G perline affinità per catturare gli anticorpidal supporto di cellule seguita da marcatura con piccole molecole utilizzando sia ammina o chimica tiolo e successiva eluizione degli anticorpi marcati. Prendendo coloranti fluorescenti come surrogati per le piccole molecole, dimostriamo l'etichettatura on-tallone di tre diversi anticorpi di topo direttamente dal supporto di cellule utilizzando sia ammina e tiolo chimica etichettatura. L'elevata affinità di legame di anticorpi anti proteine A e proteine G garantisce elevati recuperi, nonché di elevata purezza degli anticorpi marcati. Inoltre, l'uso di sfere magnetiche consente a più campioni vengano maneggiati manualmente, migliorando così significativamente il throughput di etichettatura.
Introduction
Gli anticorpi marcati con piccole molecole sono forse i reagenti più utilizzati in biologia 1,2. Anticorpi marcati con coloranti fluorescenti e biotina sono ampiamente utilizzati nella diagnostica per immagini, immunodosaggi, citometria a flusso, Western blot e immunoprecipitazione tra le altre applicazioni 3-6. Anticorpi radiomarcati 3,7 trovano ampio utilizzo nella diagnostica per immagini e la terapia, gli anticorpi marcati con farmaci citotossici (ADC) stanno offrendo nuove opzioni per il trattamento dei tumori, e due ADC sono già stati approvati per uso terapeutico 8. Nonostante il loro ampio uso, le modalità di etichettatura anticorpi sono rimasti sorprendentemente invariate e di solito sono molteplici reazioni e dissalazione passi 9-12. metodi di soluzione funzionano molto bene nei casi in cui deve essere etichettato solo pochi anticorpi e sono disponibili in forma altamente purificata ad alta concentrazione e in volumi sufficienti. Tuttavia, per le applicazioni più recenti come ADC, vi è unnecessario etichettare anticorpi nella fase ibridoma presto in modo che possano essere sottoposti a screening per proprietà biologicamente rilevanti, ad esempio, recettore-mediata anticorpo internalizzazione 13-16. Nella fase ibridoma, volumi di campione sono limitati, gli anticorpi sono espressi a basse concentrazioni e un numero di campioni sono grandi, quindi metodi di etichettatura di soluzioni basate non sono adatti.
Al fine di semplificare e migliorare il throughput dei tradizionali metodi di etichettatura degli anticorpi, alcuni approcci alternativi sono stati proposti 17,18. Un approccio consiste nell'utilizzare Protein amagnetico A perline affinità confezionati in piccole colonne di catturare anticorpi seguita dalla reazione di marcatura ed eluizione di proteina marcata e purificata. Questo metodo può essere utilizzato per etichettare anticorpi direttamente dal supporto cellulare, tuttavia, l'uso di colonne può essere laborioso. Un metodo basato branello magnetico è stato recentemente riportato 19 che elimina l'uso di colonne e produttività ma a causa miglioraall'anticorpo limitata capacità delle perline vincolante, solo nanogrammo a basse quantità microgrammi di anticorpi potrebbe essere etichettato.
Recentemente abbiamo sviluppato e usato ad alta capacità magnetica Proteina A e Proteine perline G (> 20 mg di IgG umana / ml di perline stanziali) di etichettare gli anticorpi presenti nei mezzi di cella con piccole molecole 20. L'elevata capacità delle perle permette decine a centinaia di microgrammi di anticorpo da etichettare convenientemente e la risposta magnetica rapida delle perline semplifica la gestione e il trattamento di un gran numero di campioni in parallelo. Utilizzando coloranti fluorescenti come surrogati per le piccole molecole, si dimostra che il metodo è compatibile con ammina e tiolo etichettatura chimica e offre alti recuperi di anticorpi marcati e molto puri.
Questo protocollo e il video di accompagnamento descrivono l'etichettatura on-tallone di anticorpi di topo presenti nei mezzi di comunicazione cellulari che utilizzano proteine magnetica A e G proteina perline. Il protocollo èsuddiviso in quattro sezioni: Sezione 1 descrive la cattura di anticorpi sul tallone da campioni biologici. Dopo la cattura, l'etichettatura di anticorpi con colorante fluorescente che utilizzano la chimica ammina o che utilizzano la chimica tiolo è descritta nelle sezioni 2 e la sezione 3, rispettivamente. Infine, la sezione 4 descrive il metodo per il calcolo della concentrazione di anticorpo e il colorante rapporto anticorpo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'obiettivo di questo studio era di sviluppare un metodo per etichettare anticorpi, presenti nei mezzi di cella a basse concentrazioni, con una varietà di piccole molecole. Tale metodo permette un gran numero di anticorpi, durante le prime fasi di scoperta di anticorpi, etichettato con piccole molecole e schermati con un saggio biologicamente rilevante. Uno di questi test è il test degli anticorpi internalizzazione mediata dai recettori in cui internalizzazione può variare tra gli anticorpi anche con affinità si…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
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