Выделение липопротеидов высокой плотности для Некодирующих малых РНК квантификации
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
Разнообразие малых некодирующих РНК (рРНК) быстро расширяется и их роли в биологических процессах, в том числе регуляции генов, появляются. Самое интересное, что sRNAs также находятся вне клеток и стабильно присутствуют во всех биологических жидкостях. Таким образом, внеклеточные sRNAs представляют собой новый класс биомаркеров заболеваний, и они, вероятно, участвуют в клеточной сигнализации и межклеточных сетей связи. Для того, чтобы оценить их потенциал в качестве биомаркеров, sRNAs может быть определена количественно в плазме крови, мочи и других жидкостей. Тем не менее, чтобы полностью понять влияние внеклеточных sRNAs как эндокринные сигналов, важно , чтобы определить , какие носители транспортировки и защиты их в биологических жидкостях (например, в плазме), что клетки и ткани , способствуют внеклеточные пулы Срна, и клетки и ткани , способные принятия и использования внеклеточный Срна. Для достижения этих целей, важно, чтобы изолировать высокочистых популяции внеклеточного носителейдля профилирования Срна и количественной оценки. Ранее мы показали, что липопротеиды, в частности, липопротеины высокой плотности (HDL), транспорт (функциональные микроРНК микроРНК) между клетками и ЛВП-микроРНК существенно изменяются при болезни. Здесь мы подробно новый протокол, который использует тандемный HDL изоляции с градиенте плотности ультрацентрифугирования (DGUC) и быстрого белка-жидкостной хроматографии (FPLC) для получения высокочистого HDL для нисходящего профилирования и количественной оценки всех sRNAs, в том числе микроРНК, используя как высокий -throughput секвенирования и ПЦР в реальном времени подходы. Этот протокол будет ценным ресурсом для исследования sRNAs на HDL.
Introduction
Внеклеточного-некодирующие малые РНК (sRNAs) представляют собой новый класс биомаркеров заболеваний и потенциальных терапевтических мишеней и , вероятно , облегчит клетки к клетке связи 1. Наиболее широко изученным типом рРНК являются микроРНК (миРНК) , которые приблизительно 22 NTS в длину и обрабатываются из более длинных форм – предшественников и первичных транскриптов 2. микроРНК были продемонстрированы посттранскрипционно регулируют экспрессию генов путем подавления белка трансляции и индукции деградацию мРНК 2. Тем не менее, микроРНК являются лишь одним из многих типов sRNAs; в качестве sRNAs могут быть расщеплены от родительских тРНК (тРНК производные sRNAs, TDR), малые ядерные РНК (рРНК-производных sRNAs, sndRNA), небольшие ядрышковых РНК (snoRNA-производных sRNAs, мяРНК), рибосомных РНК (рРНК происхождения sRNAs РДР ), Y РНК (yDR) и различных других РНК 1. Несколько примеров таких новых sRNAs Сообщалось, что функцию, аналогичную функции микроРНК; Однако биологические фуnctions многих из этих sRNAs еще предстоит определить, хотя роли в регуляции генов, вероятно , 3-6. Самое интересное, что микроРНК и другие sRNAs стабильно присутствуют в внеклеточной жидкости, в том числе слюны, плазмы, мочи и желчи. Внеклеточные sRNAs, вероятно, защищены от РНКазы через их ассоциации с внеклеточным везикул (EV), липопротеинов и / или внеклеточных рибонуклеопротеидных комплексов.
Ранее мы сообщали , что липопротеины, а именно липопротеины высокой плотности (ЛПВП), транспорт микроРНК в плазме 7. В этом исследовании, ЛВП были выделены с использованием последовательного метода градиента плотности ультрацентрифугирования (DGUC), быстро-жидкостной хроматографии протеинов (гель-хроматография на силикагеле, фильтрование, FPLC) и аффинной хроматографии (анти-аполипопротеина (апо-I) иммунопреципитация ) 7. Используя оба в режиме реального времени массивов на основе ПЦР с низкой плотностью и индивидуальных анализов микроРНК, уровни микроРНК были определены количественно на HDL изолированы от заживаюттвой и гиперхолестеринемией предметы 7. Используя этот подход, мы смогли в профиль микроРНК и количественно определенные микроРНК в высокочистых HDL препаратов. Начиная с 2011 года, мы определили, что, хотя аффинная хроматография повышает чистоту HDL, насыщенность антител значительно ограничивает выход, и может быть экономически запретительными. В настоящее время наш протокол рекомендует двухэтапный метод последовательного тандема DGUC с последующим FPLC, который также производит высококачественные образцы HDL для вниз потока выделения РНК и Срна количественной оценки. В связи с последними достижениями в области высокой пропускной последовательности sRNAs (sRNAseq), например, микроРНК, а также повышение уровня информированности других классов , не микроРНК Срна, sRNAseq текущее состояние-оф-искусства в микроРНК и Срна профилирования. Таким образом, наш протокол рекомендует количественное микроРНК и другие sRNAs на образцах HDL с использованием sRNAseq. Тем не менее, общая РНК, выделенной из HDL также могут быть использованы для определения индивидуальных микроРНК и других sRNAs или проверки достоверности результатов sRNAseq с помощью ПЦР в реальном времени Approaches. Здесь мы опишем подробно протокол для сбора, очистки, количественной оценки, анализа данных и проверки высокочистого HDL-sRNAs.
Основная цель данной работы заключается в демонстрации осуществимости и процесс Срна количественной оценки с высокой степенью чистоты HDL, выделенной из плазмы крови человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол предназначен для количественного определения микроРНК и других sRNAs высокой пропускной последовательности или ПЦР в реальном времени на высокочистого HDL. Как и при любом подходе, особые соображения следует уделять каждому шагу в процессе очистки HDL и РНК, а затем количест?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
