Summary

El aislamiento de las lipoproteínas de alta densidad para no codificante ARN pequeño Cuantificación

Published: November 28, 2016
doi:

Summary

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Abstract

La diversidad de pequeños ARN no codificantes (sRNA) se está expandiendo rápidamente y están surgiendo sus papeles en los procesos biológicos, incluyendo la regulación de genes,. Lo más interesante es sRNAs también se encuentran fuera de las células y se presente de forma estable en todos los fluidos biológicos. Como tal, sRNAs extracelulares representan una nueva clase de biomarcadores de la enfermedad y es probable que participan en la señalización celular y las redes de comunicación intercelulares. Para evaluar su potencial como biomarcadores, sRNAs pueden ser cuantificados en plasma, orina y otros fluidos. Sin embargo, para entender completamente el impacto de sRNAs extracelulares como señales endocrinas, es importante para determinar qué compañías están transportando y protegerlos en fluidos biológicos (por ejemplo, plasma), que las células y los tejidos contribuyen a piscinas sRNA extracelulares, y las células y los tejidos capaces de aceptar y utilizar extracelular sRNA. Para lograr estos objetivos, es fundamental para aislar poblaciones altamente puros de portadores extracelularespara sRNA de perfiles y la cuantificación. Hemos demostrado anteriormente que las lipoproteínas, en particular de las lipoproteínas de alta densidad (HDL), el transporte microARN (miARN) funcionales entre las células y el HDL-miRNAs son significativamente alteradas en la enfermedad. A continuación, detallamos un nuevo protocolo que utiliza tándem aislamiento HDL con ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC) y rápido-proteína-cromatografía líquida (FPLC) para obtener HDL de alta pureza para el perfilado de aguas abajo y cuantificación de todos los sRNAs, incluyendo miRNAs, utilizando tanto alta secuenciación -throughput y enfoques de PCR en tiempo real. Este protocolo será un recurso valioso para la investigación de sRNAs sobre el HDL.

Introduction

No codificante ARN pequeños extracelulares (sRNAs) representan una nueva clase de biomarcadores de la enfermedad y las posibles dianas terapéuticas y es probable que facilitan la comunicación de célula a célula 1. El tipo más ampliamente estudiada de sRNA son los microARN (miARN) que son aproximadamente 22 nts de longitud y se procesan a partir de formas precursoras más largas y transcritos primarios 2. miRNAs se han demostrado a la post-transcriptionally regular la expresión génica a través de la supresión de la traducción de la proteína y la inducción de la degradación del ARNm 2. Sin embargo, los miRNAs son sólo uno de los muchos tipos de sRNAs; como sRNAs pueden escindirse de ARNt padres (sRNAs tRNA derivados, TDR), pequeños ARN nucleares (sRNAs derivados sRNA, sndRNA), pequeños RNAs nucleolar (sRNAs derivados de ARNsno, snRNA), ARN ribosomal (sRNAs, RDR rRNA derivados ), y ARN (YDR), y otros ARN diverso 1. Unos pocos ejemplos de estos nuevos sRNAs se ha informado de función similar a miRNAs; sin embargo, el fu biológicanctions de muchos de estos sRNAs que queda por determinar, aunque funciones en la regulación de genes es probable 3-6. Lo más interesante, miRNAs y otros sRNAs son presente de forma estable en los fluidos extracelulares, incluyendo la saliva, plasma, orina y bilis. sRNAs extracelulares se probable protegidos de RNasas través de su asociación con vesículas extracelulares (EV), lipoproteínas, y / o complejos de ribonucleoproteínas extracelulares.

Anteriormente, se informó de que las lipoproteínas, a saber, las lipoproteínas de alta densidad (HDL), miRNAs de transporte en el plasma 7. En este estudio, HDL se aisló utilizando un método secuencial de la ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC), cromatografía líquida de proteína rápida (de exclusión por tamaño de filtración en gel cromatografía, FPLC), y cromatografía de afinidad (anti-apolipoproteína AI (apoA-I) inmunoprecipitación ) 7. Con las dos matrices en tiempo real de baja densidad basados ​​en PCR y ensayos de miARN individuales, los niveles de miARN se cuantificaron sobre el HDL aisladas de curartu y 7 sujetos hipercolesterolémicos. Con este enfoque, hemos sido capaces de perfil miRNAs y cuantificar miRNAs específicos en las preparaciones de HDL de alta pureza. Desde 2011, se ha determinado que a pesar de cromatografía de afinidad mejora la pureza del HDL, la saturación de anticuerpos limita en gran medida el rendimiento, y puede ser un costo prohibitivo. Actualmente, el protocolo recomienda un método tándem secuencial de dos etapas de DGUC seguido de FPLC, que también produce muestras de HDL de alta calidad para aguas abajo aislamiento de ARN y cuantificación sRNA. Debido a los recientes avances en la secuenciación de alto rendimiento de sRNAs (sRNAseq), por ejemplo, los miRNAs, y el aumento de la conciencia de otras clases no miARN sRNA, sRNAseq es el estado actual de la técnica en el miARN y sRNA perfiles. Como tal, nuestro protocolo recomienda que cuantifican miRNAs y otros sRNAs en muestras de HDL utilizando sRNAseq. No obstante, el ARN total aislado de HDL también se puede utilizar para cuantificar miRNAs individuales y otros sRNAs o validar los resultados sRNAseq usando PCR en tiempo real unapproaches. A continuación se describe en detalle un protocolo para la extracción, purificación, cuantificación, análisis de datos y validación de alta pureza HDL-sRNAs.

El objetivo general de este trabajo es demostrar la viabilidad y el proceso de cuantificación en sRNA HDL altamente puro aislado del plasma humano.

Protocol

1. Purificación HDL (~ 5,5 días) La ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC, ~ 5 días) Añadir 90 l de 100x antioxidantes para 9 ml de plasma aisladas de sangre venosa fresca. Ajuste la densidad de plasma con KBr de 1,006 g / ml a 1,025 g / ml mediante la adición de 0,251 g de KBr a 9 ml de plasma de la Etapa 1.1.1 (0,0278 g / ml de plasma KBr). Rock the plasma hasta que toda la sal se disuelve a temperatura ambiente y transferir ultracentrifugar tubos y asegurar que todas l…

Representative Results

Este protocolo es una serie de métodos establecidos unidos entre sí para permitir la cuantificación de sRNAs en HDL altamente puro mediante secuenciación de alto rendimiento o en tiempo real PCR (Figura 1). Para demostrar la viabilidad y el impacto de este protocolo, el HDL se purificó a partir de plasma humano por el método DGUC y FPLC tándem. Las fracciones recogidas correspondientes a FPLC HDL (por la distribución de colesterol) se concentraron y el ARN total …

Discussion

Este protocolo está diseñado para cuantificar miRNAs y otros sRNAs por secuenciación de alto rendimiento o PCR en tiempo real sobre el HDL altamente puro. Al igual que con cualquier enfoque, las consideraciones especiales se deben dar a cada paso en el proceso de purificación de HDL y ARN y luego cuantificar sRNAs. Este protocolo está diseñado para los proyectos iniciados con ≥ 2 ml de plasma. Sin embargo, los análisis de ARN de alta calidad con éxito se pueden completar con HDL purificada a partir de tan poco…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.

Materials

Ultracentrifuge  Beckman Coulter A99839 Optima XPN-80
Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 331362 SW-41Ti
AKTA Pure FPLC System GE Healthcare 29018224
3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line GE Healthcare 28990944 10/300 gl
SynergyMx BioTek Instruments 7191000
Tabletop centrifuge Thermo Scientific 75004525 Sorvall ST40R
Refrigerated centrifuge Eppendorf 22629867 5417R (purchased through USA Scientific)
Microfuge  USA Scientific 2631-0006
PippenPrep Sage Science PIP0001
2100 Bioanalyzer  Agilent G2938B
High Sensitivity DNA Assay Agilent 5067-4626
Sequencing Library qPCR Quantification Kit Illumina SY-930-1010
ProFlex Thermal Cycler Applied Biosystems 4484073
QuantStudio 12k Flex Applied Biosystems 4471134
EpMotion Robot Eppendorf 960000111 5070
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
Potassium Bromide Fisher Chemicals P205-500
15 mL conical tube Thermo Scientific 339650
Micro-centrifugal filters 0.45µm Millipore UFC30HV00
Micro-centrifugal filters 0.22µm Millipore UFC30GV00
miRNAEasy Total RNA Isolation Kits Qiagen 217004
Total Cholesterol colormetric kit Cliniqa (Raichem) R80035
10,000 m.w. cut-off centrifugation filter Amicon UFC801024 purchased through Millipore
PCR strip tubes Axygen PCR-0208-C purchased through Fisher
microRNA RT kit Life Technologies 4366597 For 1000 reactions
PCR master mix Life Technologies 4440041 50 mL bottle
Pierce BCA kit Thermo Scientific 23225
Clean and Concentrator Kit Zymo D4014
Dialysis tubing Spectrum Labs 132118 purchased through Fisher
bcl2fastq2 Illumina n/a Software
Cutadapt https://github.com/marcelm/cutadapt n/a Software
NGSPERL github.com/shengqh/ngsperl n/a Software
CQSTools github.com/shengqh/CQS.Tools n/a Software
Bowtie 1.1.2  http://bowtie-bio.sourceforge.net n/a Software
GeneSpringGX13.1.1 Agilent n/a Software

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Michell, D. L., Allen, R. M., Landstreet, S. R., Zhao, S., Toth, C. L., Sheng, Q., Vickers, K. C. Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification. J. Vis. Exp. (117), e54488, doi:10.3791/54488 (2016).

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