Isolement de lipoprotéines de haute densité pour les non-codant petit ARN Quantification
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
La diversité des petits ARN non codants (ARNs) est en pleine expansion et leur rôle dans les processus biologiques, y compris la régulation des gènes, sont en train d'émerger. Le plus intéressant, ARNs sont également trouvés à l'extérieur des cellules et sont présents de manière stable dans tous les fluides biologiques. En tant que tel, ARNs extracellulaires représentent une nouvelle classe de biomarqueurs de la maladie et sont probablement impliqués dans la signalisation cellulaire et les réseaux de communication intercellulaire. Pour évaluer leur potentiel en tant que biomarqueurs, ARNs peuvent être quantifiés dans le plasma, l'urine et d'autres fluides. Néanmoins, pour comprendre pleinement l'impact des ARNs extracellulaires comme des signaux endocriniens, il est important de déterminer quels transporteurs transportent et de les protéger dans les fluides biologiques (par exemple, plasma), dont les cellules et les tissus contribuent à des pools de ARNs extracellulaires, et les cellules et les tissus capables d'accepter et d'utiliser extracellulaire ARNs. Pour atteindre ces objectifs, il est essentiel d'isoler des populations très pures des transporteurs extracellulairesARNs pour le profilage et la quantification. Nous avons déjà démontré que les lipoprotéines, en particulier les lipoprotéines de haute densité (HDL), le transport de microARN (miARN fonctionnels) entre les cellules et HDL-miARN sont significativement altérées dans la maladie. Ici, nous détaillons un nouveau protocole qui utilise tandem isolement HDL avec gradient de densité ultracentrifugation (DGUC) et rapide aux protéines chromatographie liquide (FPLC) pour obtenir HDL très pur pour le profilage aval et la quantification de tous les ARNs, y compris miARN, utilisant à la fois haute Le séquençage -throughput et des approches de PCR en temps réel. Ce protocole sera une ressource précieuse pour l'étude des ARNs sur HDL.
Introduction
Extracellulaires non codantes petits ARN (ARNs) représentent une nouvelle classe de biomarqueurs de la maladie et des cibles thérapeutiques potentielles et susceptibles de faciliter la cellule à cellule communication 1. Le type le plus largement étudié des ARNs sont microARN (miARN) qui sont environ 22 nts de longueur et sont traités de plus longues formes précurseurs et transcrits primaires 2. miARN a été démontré que la post-transcriptionnel réguler l' expression génique par la suppression de la conversion des protéines et de l' induction de la dégradation de l' ARNm 2. Néanmoins, les miARN sont juste un des nombreux types de ARNs; comme ARNs peuvent être clivés de ARNt mères (des ARNs ARNt dérivés, TDR), petits ARN nucléaires (ARNs ARNs dérivés, sndRNA), petits ARN nucléolaires (des ARNs snoRNA dérivés, snARN), ARNs ribosomiques (ARNs, rdr ARNr dérivé ), Y (ARN ydr) et d' autres divers ARNs 1. Quelques exemples de ces nouveaux ARNs ont été rapportés à fonction similaire à celle miARN; cependant, le fu biologiquenctions de beaucoup de ces ARNs reste à déterminer, bien que les rôles dans la régulation des gènes sont susceptibles 3-6. Le plus intéressant, et d'autres miARN ARNs sont présents de manière stable dans les fluides extra-cellulaires, y compris la salive, le plasma, l'urine et la bile. ARNs extracellulaires sont probablement protégés de RNases par leur association avec des vésicules extracellulaires (EV), les lipoprotéines, et / ou complexes de ribonucléoprotéines extracellulaires.
Auparavant, nous avons signalé que les lipoprotéines, à savoir les lipoprotéines de haute densité (HDL), miARN de transport dans le plasma 7. Dans cette étude, les HDL ont été isolés à l'aide d'un procédé séquentiel d'une ultracentrifugation en gradient de densité (DGUC), la chromatographie liquide rapide de protéines (par exclusion de taille sur gel de chromatographie de filtration, FPLC) et la Chromatographie d'affinité (AI anti- apolipoprotéine (apoA-I) immunoprécipitation ) 7. En utilisant les deux en temps réel basés sur la PCR des réseaux à faible densité et des essais de miARN individuels, les niveaux de miARN ont été quantifiés sur HDL isolés de guérirton et les sujets hypercholestérolémiques 7. En utilisant cette approche, nous avons pu le profil de miARN et quantifier miARN spécifiques dans des préparations de HDL très pures. Depuis 2011, nous avons déterminé que, bien que la chromatographie d'affinité améliore la pureté de HDL, la saturation des anticorps limite fortement le rendement, et peut être un coût prohibitif. Actuellement, notre protocole recommande une méthode tandem séquentielle en deux étapes de DGUC suivie par FPLC, qui produit également des échantillons de HDL de haute qualité pour l'isolement en aval de l'ARN et ARNs quantification. En raison des récents progrès dans le séquençage à haut débit de ARNs (sRNAseq), par exemple, miARN et la prise de conscience accrue des autres classes non-miARN ARNs, sRNAseq est l'état actuel de la technique dans miRNA et ARNs profilage. En tant que tel, notre protocole recommande miARN quantifier et d'autres ARNs sur des échantillons HDL utilisant sRNAseq. Néanmoins, l'ARN total isolé de HDL peut également être utilisé pour quantifier les miARN individuels et d'autres ARNs ou de valider les résultats de sRNAseq en utilisant PCR en temps réel unepproches. Ici, nous décrivons en détail un protocole pour la collecte, la purification, la quantification, l'analyse des données, et la validation de haute pureté HDL-ARNs.
L'objectif global de cet article est de démontrer la faisabilité et le processus de ARNs quantification dans HDL très pur isolé du plasma humain.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole est conçu pour quantifier miARN et d'autres ARNs par séquençage à haut débit ou PCR en temps réel sur le HDL très pur. Comme pour toute approche, des considérations particulières devraient être données à chaque étape du processus de purification de HDL et de l'ARN, puis quantifier ARNs. Ce protocole est conçu pour des projets commençant par ≥ 2 mL de plasma. Néanmoins, des analyses d'ARN de haute qualité peuvent être complétés avec succès HDL purifié à partir d'aussi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
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