Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar çeşitliliği (Srna) hızla genişlemektedir ve gen regülasyonu dahil olmak üzere biyolojik süreçlerde, rolleri, ortaya çıkmaktadır. İlginç olan, sRNAs ayrıca hücrelerin dışında bulunan ve sabit bir şekilde tüm biyolojik sıvılar içinde mevcut bulunmaktadır. Bu nedenle, hücre dışı sRNAs hastalığı biyomarkerler yeni bir sınıfını temsil eder ve büyük olasılıkla hücre sinyal iletimi ve hücreler arası iletişim ağları dahil olmaktadır. biyolojik olarak potansiyellerini değerlendirmek için, sRNAs plazma, idrar ve diğer sıvıları belirlenebilir. Bununla birlikte, tam endokrin sinyaller olarak hücre dışı sRNAs etkisini anlamak için, taşıyıcıları taşınması ve hücre ve dokular dışı Srna havuzları katkıda biyolojik sıvılarda (örneğin, plazma), onları korumak ve hücreler ve yetenekli dokular olduğunu belirlemek önemlidir kabul ediyor ve hücre dışı Srna kullanan. Bu hedeflere ulaşmak için, hücre-dışı taşıyıcıların yüksek derecede saf popülasyonlarının izole edilmesi için önemlidirSrna profil ve ölçümü için. Daha önce lipoproteinler, özellikle yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL), hücre ve HDL-miRNA'ların arasında işlevsel microRNA (MiRNA) önemli ölçüde hastalık değişmiş taşıma olduğunu göstermiştir. Burada, detay yoğunluk-gradyan Ultrasantrifügasyon (DGUC) ve hızlı protein-sıvı kromatografisi (FPLC) ile tandem HDL izolasyonunu kullanan yeni bir protokol yüksek ikisini de kullanarak, aşağı profilleme ve miRNA'ların dahil olmak üzere tüm sRNAs, ölçümü için son derece saf HDL elde etmek için -throughput sekanslama ve gerçek zamanlı PCR yaklaşımlar. Bu protokol HDL üzerinde sRNAs araştırılması için değerli bir kaynak olacaktır.
Introduction
Ekstrasellüler kodlamayan küçük RNA'lar (sRNAs) hastalığı biyomarkerlerin ve potansiyel terapötik hedeflerin yeni bir sınıfını temsil ve muhtemel hücre-hücre iletişimi 1 kolaylaştırır. Srna en çok çalışılan tip uzunluğu yaklaşık 22 NTS ve daha uzun habercisi formları ve primer transkript 2 işlenir mikroRNAlar (miRNA) 'dir. miRNA'lar transkripsiyonel-sonrası protein çevirisinin ve mRNA degradasyon 2 indüksiyonu bastırılması vasıtasıyla gen ekspresyonunu düzenlemek için gösterilmiştir. Bununla birlikte, miRNA'ların sRNAs birçok türleri sadece biri; sRNAs üst tRNA'ların (tRNA türetilmiş sRNAs TDR), küçük nükleer RNA (Srna türetilmiş sRNAs, sndRNA), küçük çekirdekçik RNA'lar (snoRNA türetilmiş sRNAs, snRNA), ribozomal RNA klivaj edilebilir (sRNAs RDR rRNA türetilmiş ) Y RNA'lar (yDR) ve diğer çeşitli RNA'lar 1. Bu yeni sRNAs birkaç örnek miRNA'ların benzer işlev bildirilmiştir; Ancak, biyolojik fugen düzenlemesi roller 3-6 olasılığı olmasına rağmen, bu sRNAs birçok nctions tespit edilmesi gerekmektedir. İlginç olan, miRNA'ların ve diğer sRNAs tükürük, plazma, idrar, safra içeren hücre dışı akışkanlar içinde stabil bir şekilde yer almaktadır. Ekstrasellüler sRNAs olasılıkla ekstrasellüler veziküllerin (EV), lipoproteinler ve / veya hücre dışı Ribonükleoprotein kompleksleri ile dernek aracılığıyla RNases korunur.
Daha önce, bu lipoproteinlerin, yani, yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) plazma 7 taşıma miRNA'lar bildirilmiştir. Bu çalışmada, HDL ardışık yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme yöntemi (DGUC), hızlı protein sıvı kromatografi (boyut dışlama kromatografisi, jel filtrasyon, FPLC) ve afinite kromatografisi (anti-apolipoprotein Al (apoA-l) imüno kullanılarak izole edildi ) 7. Gerçek zamanlı PCR bazlı, düşük yoğunluklu diziler ve bireysel MiRNA analizlerine kullanarak MiRNA düzeylerde HDL üzerindeki sayısal iyileşmesi izole edildisenin ve hiperkolesterolemik konular 7. Bu yaklaşımı kullanarak, biz miRNA'lar profil ve oldukça saf HDL hazırlıkları belirli miRNA'lar ölçmek için başardık. 2011 yılından bu yana afinite kromatografisi HDL saflığı artırır, ancak antikor doygunluk büyük ölçüde verim sınırlar ve maliyet açısından çok pahalı olabilir belirledik. Şu anda, bizim protokol aynı zamanda aşağı akım RNA izolasyonu ve Srna ölçümü için yüksek kaliteli, HDL örnekleri üreten FPLC, ardından DGUC bir iki adımlı sıralı tandem yöntemi önerir. Nedeniyle yüksek verimli örneğin sRNAs (sRNAseq), miRNA'lar sıralanması, ve diğer non-miRNA Srna sınıfların artan farkındalık son gelişmeler için, sRNAseq cari state-of-the-art miRNA ve Srna profilleme. Bu nedenle, bizim protokol miktarının miRNA'lar ve sRNAseq kullanarak HDL örneklerinde diğer sRNAs önerir. Bununla birlikte, HDL izole edilmiş toplam RNA da tek tek miRNA'lar ve sRNAs ölçmek veya gerçek zamanlı PCR kullanılarak sRNAseq Sonuçları doğrulamak için kullanılabiliryaklaşırsa. Burada toplama, arıtma, ölçümü, veri analizi ve oldukça saf HDL-sRNAs doğrulanması için detaylı bir protokol açıklar.
Bu yazıda genel amacı, insan plazmasından izole son derece saf HDL Srna ölçümü fizibilite ve süreci göstermektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, yüksek derecede saf HDL, yüksek verimli sekanslama ya da gerçek-zamanlı PCR ile miRNA'lar ve sRNAs ölçmek için tasarlanmıştır. Herhangi bir yaklaşımla olduğu gibi, özel durumlar arındırıcı HDL ve RNA sürecinde her adımda verilen ve daha sonra sRNAs ölçülmesi gerekir. Bu protokol, plazma ≥ 2 mL başlayarak projeler için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, yüksek kalitede RNA analizleri başarılı afinite kromatografisi kullanılarak, insan ya da fare plazması az 80, uL safla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
