Isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende RNA kwantificering Klein
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
De diversiteit van kleine niet-coderende RNA's (sRNA) breidt zich snel uit en hun rol in biologische processen, met inbegrip van genregulatie, zijn in opkomst. Meest interessant zijn sRNAs ook gevonden buiten de cellen en zijn stabiel in alle biologische vloeistoffen. Als zodanig extracellulaire sRNAs vertegenwoordigen een nieuwe klasse van ziekten biomerkers en zijn waarschijnlijk betrokken bij cel signalering en intercellulaire communicatie netwerken. Hun potentieel als biomarkers beoordelen, kan sRNAs worden gekwantificeerd in plasma, urine en andere vloeistoffen. Niettemin volledig begrijpen van de invloed van extracellulaire sRNAs endocriene signalen, is het belangrijk om te bepalen welke dragers transporteren en te beschermen in biologische vloeistoffen (bijvoorbeeld plasma), die cellen en weefsels bijdragen aan extracellulaire sRNA zwembaden, en cellen en weefsels in staat van het accepteren en het gebruik van extracellulaire sRNA. Om deze doelen te bereiken, is het essentieel om zeer zuivere populaties van extracellulaire dragers isolerenvoor sRNA profilering en kwantificering. We hebben eerder aangetoond dat lipoproteïnen, in het bijzonder high-density lipoproteïnen (HDL), functionele microRNA's (miRNA) tussen cellen en HDL-miRNAs is significant veranderd bij ziekte vervoeren. Hier hebben we detail een nieuw protocol dat tandem HDL isolatie gebruikt met een dichtheid-gradiënt ultracentrifugatie (DGUC) en fast-eiwit-vloeistofchromatografie (FPLC) tot zeer pure HDL krijgen voor downstream profilering en kwantificering van alle sRNAs, met inbegrip van miRNAs, met behulp van zowel een hoge -throughput sequencing en real-time PCR benaderingen. Dit protocol zal een waardevolle bron voor het onderzoek naar sRNAs op HDL zijn.
Introduction
Extracellulaire niet-coderende kleine RNAs (sRNAs) vertegenwoordigen een nieuwe klasse van ziekten biomerkers en potentiële therapeutische doelwitten en waarschijnlijk cel-cel 1 te vergemakkelijken. De meest bestudeerde soort sRNA zijn microRNAs (miRNA) die ongeveer 22 gen in lengte en van langere voorloper vormen en primaire transcripts 2 worden verwerkt. miRNAs is aangetoond post-transcriptioneel genexpressie door middel van onderdrukking van eiwittranslatie en inductie van mRNA degradatie 2. Toch miRNAs zijn slechts een van de vele soorten sRNAs; zoals sRNAs kan worden afgesplitst van ouder tRNA (-tRNA afgeleid sRNAs, TDR), kleine nucleaire RNA's (sRNA-afgeleide sRNAs, sndRNA), kleine nucleolair RNA's (snoRNA-afgeleide sRNAs, snRNA), ribosomaal RNA (rRNA-afgeleide sRNAs, RDR ), Y RNAs (YDR), en andere diverse RNAs 1. Enkele voorbeelden van deze nieuwe sRNAs gemeld Soortgelijke miRNAs functioneren; De biologische functions van veel van deze sRNAs nog worden bepaald, hoewel rollen in genregulatie waarschijnlijk 3-6. Het meest interessante miRNAs en andere sRNAs zijn stabiel aanwezig in extracellulaire vloeistoffen zoals speeksel, plasma, urine en gal. Extracellulaire sRNAs zijn waarschijnlijk beschermd RNases via hun associatie met extracellulaire blaasjes (EV), lipoproteïnen en / of extracellulaire ribonucleoproteïne complexen.
Eerder hebben we gemeld dat lipoproteïnen, namelijk high-density lipoproteïnen (HDL), transport miRNAs in plasma 7. In deze studie werden HDL geïsoleerd met behulp van een sequentiële werkwijze dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie (DGUC), fast-proteïne vloeistofchromatografie (grootte-uitsluitingschromatografie gelfiltratie FPLC) en affiniteitschromatografie (anti-apolipoproteïne AI (apoA-I) immunoprecipitatie ) 7. Waarbij zowel real-time PCR-gebaseerde lage-dichtheid arrays en individuele miRNA assays werden miRNA niveaus gekwantificeerd HDL geïsoleerd uit heelthy en hypercholesterolemic onderwerpen 7. Met behulp van deze aanpak, waren we in staat om miRNAs profileren en te kwantificeren specifieke miRNAs in zeer zuivere HDL preparaten. Sinds 2011 hebben we vastgesteld dat hoewel affiniteitschromatografie verhoogt HDL zuiverheid antilichaam verzadiging sterk beperkt rendement en kunnen kosten prohibitief zijn. Momenteel, ons protocol beveelt een tweestaps opeenvolgende tandemmethode van DGUC gevolgd door FPLC, die ook produceert HDL monsters van hoge kwaliteit voor downstream RNA isolatie en kwantificering sRNA. Als gevolg van de recente vooruitgang in high-throughput sequencing van sRNAs (sRNAseq), bijvoorbeeld, miRNAs, en het toegenomen bewustzijn van andere niet-miRNA sRNA klassen, sRNAseq is de huidige state-of-the-art in miRNA en sRNA profilering. Als zodanig, ons protocol raadt het kwantificeren van miRNAs en andere sRNAs op HDL monsters met behulp van sRNAseq. Niettemin totaal RNA geïsoleerd uit HDL kan ook worden gebruikt om individuele miRNAs en andere sRNAs kwantificeren of valideren sRNAseq resultaten middels real-time PCR eenpproaches. Hier beschrijven we in detail een protocol voor het verzamelen, zuivering, de kwantificering, data-analyse, en validatie van zeer zuiver HDL-sRNAs.
Het algemene doel van dit artikel is om de haalbaarheid en het proces van sRNA kwantificering demonstreren in zeer zuiver HDL geïsoleerd uit menselijk plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is ontworpen om miRNAs en andere sRNAs kwantificeren high-throughput sequencing of real-time PCR op zeer zuiver HDL. Zoals bij elke andere aanpak dient speciale overwegingen worden om elke stap in het proces van het zuiveren HDL en RNA en kwantificeren sRNAs. Dit protocol is bedoeld voor projecten ab ≥ 2 ml plasma. Toch kan een hoge kwaliteit RNA analyses gevolg zijn afgerond met HDL gezuiverd uit slechts 80 ul humaan of muizen plasma middels affiniteitschromatografie; echter, grotere uitgangspunt plasma …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
