عزل البروتينات الدهنية عالية الكثافة لغير الترميز الصغيرة RNA الكمي
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
تنوع الرنا غير الترميز صغيرة (الحمض الريبي النووي الذواب) توسعا سريعا ودورهم في العمليات البيولوجية، بما في ذلك تنظيم الجينات، آخذة في الظهور. الأمر المثير للاهتمام، وجدت sRNAs أيضا خارج الخلايا وتكون موجودة في جميع السوائل البيولوجية ثابت. على هذا النحو، تمثل sRNAs خارج الخلية فئة جديدة من المؤشرات الحيوية المرض ويشارك على الأرجح في الخلايا مما يشير الى وشبكات الاتصالات بين الخلايا. لتقييم قدراتهم والمؤشرات الحيوية، sRNAs يمكن قياسها كميا في البلازما والبول، وغيرها من السوائل. مع ذلك، إلى فهم كامل للتأثير sRNAs خارج الخلية كإشارات الغدد الصماء، فمن المهم تحديد ناقلات التي تنقل وتحميهم في السوائل البيولوجية (على سبيل المثال، البلازما)، والتي تساهم الخلايا والأنسجة لحمامات الحمض الريبي النووي الذواب خارج الخلية، والخلايا والأنسجة قادرة قبول واستخدام خارج الخلية الحمض الريبي النووي الذواب. ولتحقيق هذه الأهداف، فمن الأهمية بمكان لعزل السكان نقية للغاية من الناقلات خارج الخليةلالتنميط الحمض الريبي النووي الذواب وتقدير. لقد أثبتنا سابقا أن البروتينات الدهنية، وخاصة البروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL)، والنقل الرنا الميكروية وظيفية (ميرنا) بين الخلايا وHDL-miRNAs تتغير بشكل ملحوظ في المرض. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول جديد أن تستخدم جنبا إلى جنب HDL العزلة مع تنبيذ فائق الكثافة التدرج (DGUC) وسريع البروتين السائل اللوني (FPLC) للحصول على HDL نقية للغاية لتحديد ملامح المصب وتقدير من جميع sRNAs، بما في ذلك miRNAs، وذلك باستخدام كلا عالية التسلسل -throughput والنهج PCR في الوقت الحقيقي. وهذا البروتوكول أن يكون مصدرا قيما للتحقيق في sRNAs على HDL.
Introduction
الترميز غير الرنا خارج الخلية الصغيرة (sRNAs) تمثل فئة جديدة من المؤشرات الحيوية المرض والأهداف العلاجية المحتملة، ومن المرجح تسهل خلية الى خلية الاتصال 1. النوع الأكثر درس على نطاق واسع من الحمض الريبي النووي الذواب والرنا الميكروية (ميرنا) التي ما يقرب من 22 اليلة في الطول، ويتم معالجتها من أشكال السلائف أطول والنصوص الأولية 2. أثبتت miRNAs للنشر ما بعد transcriptionally تنظيم التعبير الجيني من خلال قمع ترجمة البروتين وتحريض تدهور مرنا 2. ومع ذلك، miRNAs هي مجرد واحدة من العديد من أنواع sRNAs. كما sRNAs يمكن المشقوق من tRNAs الأم (sRNAs المشتقة من الحمض الريبي النووي النقال، تقرير التجارة والتنمية)، الرنا صغيرة النووية (sRNAs المستمدة الحمض الريبي النووي الذواب، sndRNA)، الرنا صغيرة نويي (sRNAs المستمدة snoRNA، snRNA)، الرنا الريباسي (sRNAs، RDR الريباسي المشتقة )، Y الرنا (yDR)، وغيرها من الرنا المتنوعة 1. وقد أبلغ عن أمثلة قليلة من هذه sRNAs الرواية إلى وظيفة مماثلة لmiRNAs. ومع ذلك، فإن فو البيولوجيnctions العديد من هذه sRNAs ويبقى أن تحدد، على الرغم من الأدوار في تنظيم الجينات من المرجح 3-6. الأمر المثير للاهتمام، miRNAs وsRNAs أخرى موجودة مستقر في السوائل خارج الخلية، بما في ذلك اللعاب، والبلازما والبول، والصفراء. ومن المرجح حماية sRNAs خارج الخلية من RNases من خلال ارتباطهم مع حويصلات خارج الخلية (EV)، البروتينات الدهنية، و / أو المجمعات بروتين نووي ريبوزي خارج الخلية.
سابقا، وذكرت أن البروتينات الدهنية، وهي البروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL)، miRNAs النقل في البلازما 7. في هذه الدراسة، تم عزل HDL باستخدام طريقة متتابعة من تنبيذ فائق الكثافة التدرج (DGUC)، البروتين بسرعة اللوني السائل (حجم الاستبعاد هلام اللوني الترشيح، FPLC)، وتقارب اللوني (مكافحة ئي منظمة العفو الدولية (برنامج عمل ألماتي-I) مناعي ) 7. باستخدام كل الوقت الحقيقي PCR القائم صفائف منخفض الكثافة والمقايسات ميرنا الفردية، وتم قياس كمية مستويات ميرنا على HDL معزولة عن شفاءخاصتك والمواضيع hypercholesterolemic 7. باستخدام هذا النهج، كنا قادرين على البيانات الشخصية miRNAs وتحديد miRNAs محددة في الاستعدادات HDL نقية للغاية. منذ عام 2011، فقد قررنا أنه على الرغم اللوني تقارب يعزز HDL النقاء، الأجسام المضادة التشبع يحد بدرجة كبيرة الغلة، ويمكن أن تكون باهظة التكلفة. حاليا، يوصي بروتوكول لدينا على بعد خطوتين طريقة جنبا إلى جنب متسلسل من DGUC تليها FPLC، التي تنتج أيضا عينات HDL عالية الجودة لأسفل مجرى عزل الحمض النووي الريبي والحمض الريبي النووي الذواب الكمي. بسبب التطورات الحديثة في التسلسل الإنتاجية العالية من sRNAs (sRNAseq)، على سبيل المثال، miRNAs، وزيادة الوعي من الطبقات غير ميرنا الحمض الريبي النووي الذواب أخرى، sRNAseq هو تيار دولة من بين الفن في ميرنا والحمض الريبي النووي الذواب التنميط. على هذا النحو، يوصي بروتوكول لدينا قياس miRNAs وsRNAs الآخرين على عينات HDL باستخدام sRNAseq. ومع ذلك، الحمض النووي الريبي مجموع معزولة عن HDL يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد miRNAs الفردية وsRNAs الآخرين أو التحقق من صحة النتائج sRNAseq في الوقت الحقيقي باستخدام PCR لpproaches. نحن هنا تصف بالتفصيل بروتوكول لجمع وتنقية والتقدير الكمي، وتحليل البيانات، والتحقق من صحة نقية للغاية HDL-sRNAs.
ويتمثل الهدف العام من هذه الورقة هو لإثبات جدوى وعملية من الحمض الريبي النووي الذواب الكمي في HDL نقية للغاية معزولة من البلازما البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد miRNAs وsRNAs الآخرين من خلال الإنتاجية العالية التسلسل أو في الوقت الحقيقي PCR على HDL نقية للغاية. كما هو الحال مع أي نهج، ينبغي إيلاء اعتبار خاص لكل خطوة في عملية HDL تنقية وRNA ومن ثم قياس sRNAs. تم تصميم هذا البروتوكول لمشاريع بدءا ≥ 2 مل من البلاز…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
