準備とシリアルフェムト秒結晶学のための脂質立方相におけるタンパク質微結晶の配達

1.フィルタリングソリューションと脂質注：このプロトコルで使用される全ての試薬およびツールは、LCPインジェクタを詰まらせることができ、試料中の粒子状汚染物質の導入を避けるために、可能な限りきれいにする必要があります。 5μmのスピンダウンフィルタを介してすべての沈殿剤溶液を、溶融脂質をフィルタリングします。きれいなシリンジ徹底的に乾燥させるために圧縮空気を適用します。必要に応じて、サンプル調製手順の間ダスト粒子または繊維をトラップ防止するために、携帯用のクリーンルームフードを使用しています。 LCPでのMPの2の再構成注：結晶化のための最良のLCPホスト脂質の選択は、対象MPに依存し、典型的にはホスト脂質スクリーニング結晶化試験14中に識別されます。モノアシルグリセロール（MAGのは）、LCP結晶15に使用される脂質の最も一般的なクラスを表します。プロトコルは、以下のように9.9 MAG（モノオレイン）を使用してに基づいていますこの日付から16 メソ結晶化のための最も成功した脂質であることから、脂質をホストします。 9.9 MAGは、それらの相挙動におけるアカウントの違いを考慮した後に他のLCPホスト脂質または脂質混合物によって置換することができます。例えば、GPCRの場合には、モノオレインは、典型的には、受容体の安定化のためにコレステロールがドープされています。 （w / w）の9.9 MAG 1：ホスト脂質としてコレステロールの混合物をここでは、9を使用します。 混合物は、以前に13のように、2つのシリンジ（＃1及び＃2）を使用して、適切なLCPホスト脂質とカプラーと、界面活性剤ミセル溶液中で精製されるMPをターゲット。 簡単に言えば、MP溶液で溶融脂質とシリンジ＃2と負荷シリンジ＃1。ちょうど対応するLCPホスト脂質の最大の水和容量を下回るレベルに対応した脂質、水性MP溶液との間の比率を使用して、 例えば 、3：9.9 MAG 2 V / V脂質/ MP液、1：1 V / V他のほとんどの短鎖のMAGのための脂質/ MP溶液（7.9 MAG9.7 MAG など ）。 シリンジカプラを介してシリンジを接続し、試料が均一かつ透明になるまで、シリンジの間で前後に混合物を移動するためにプランジャーを押すことにより、物質を混合開始します。 LCP-SFXによって完全なデータセットを収集するためにLCPサンプルの約50μLを準備します。最終的な試料体積は、典型的には、サンプルの統合と脂質滴定（第5節）後（〜100μLまで）約2の係数で増加します。 3.注射器で結晶化を設定します透明で均質なLCPが形成された後、シリンジ＃2にサンプル全体を移動します。シリンジ＃2に接続されたカプラを維持しながら、シリンジ＃1を切り離します。 別の100μlのクリーンシリンジ（注射器＃3）とそれへの沈殿剤溶液の吸引約70μlに取り外し可能な針（ゲージ26S）を接続します。 Fをトリガする沈殿剤溶液の組成高密度微結晶のormationは、各ターゲットのMPのためのユニークであり、これらのプロトコルに進む前に決定されるべきです。ここで、A 2A受容体の微結晶のシャワー（40 mMのチオシアン酸ナトリウム、100mMのクエン酸ナトリウムpHは5、26から28パーセントPEG400）が得られる最適化された沈殿剤溶液組成物を使用しています。 シリンジ内のテフロンフェラルを維持しながらシリンジ＃3から針を外します。 テフロンフェルールは、両方の注射器の代わりに、正しくあることを確認して、カプラを介してシリンジ＃2、＃3を接続します。慎重に所定の位置にしっかりとカプラーをネジ止めします。 オリエント底部にシリンジ＃2と垂直に結合された注射器とLCP文字列がシリンジ＃3のプランジャに触れるまでゆっくりと着実にシリンジ＃3にシリンジ＃2からのタンパク質を含んだLCPのサンプルを注入します。注入されたLCPのボリュームは、シリンジ＃3（〜7マイクロリットル）で、約1/10の初期沈殿剤の体積のに達するだろう。両方のシリの目盛読み取りにより音量を確認してくださいNGES（両方のプランジャが約7マイクロリットルによって移動する必要があります）。 外しシリンジ＃2。カプラーは、現在のみ沈殿剤溶液中に浸漬したサンプルを含んでいる注射＃3に接続されています。 完全にプランジャーシリンジインターフェイス、カプラの開口端と、針ナットを含むシリンジ＃3を、密封するためにパラフィルムを使用してください。この工程の間の不完全なシールは、沈殿条件を変化させることができ、試料を脱水します。 繰り返しは、LCPのサンプル（各シリンジあたりLCPの〜7マイクロリットル）の〜50μlの合計を利用し6追加の注射器に（9＃4-＃）の結晶化を設定するには3.3から3.7を繰り返します。 ストアは、1または2つのファイバー・フリーの洗浄組織サンプル脱水から保護するために、水で予め浸漬してプラスチック製の密閉可能な袋で注射器を密封されました。結晶成長中に20℃のインキュベーター内でバッグや店舗の注射器を封印。 4.クリスタル検出 LC画像にインキュベーターからシリンジを取り外し直接注射器内部のP個のサンプル（＃3-＃9）は、クロス偏光を持つ実体顕微鏡下でのすべての12-24時間。 LCPフィラメントから均一なグローなどの小さい結晶サイズの場合には、密集した光沢のある粒子のような結晶を特定したり。 バッグに密封された注射器を戻し、将来の使用のために20℃で保存します。 7.9 MAGと5.サンプルの統合と滴定注：ここで説明した脂質滴定ステップは、2つの目的があります：a）は、過剰な沈殿剤液を吸収すると、b）XFELビームへの注入時に凍結脂質を防ぐために。 9.9 MAGからなるLCP試料をデータ収集のために真空チャンバ内に注入されると、集中的な蒸発は、層状結晶相へのサンプルの一部を変換し、平衡相転移温度（〜18℃）以下の温度まで試料を冷却することができます（LC）。ビームが当たっLC相、これらのパッチは、強烈な粉末DIFFRを生成しますこのようなコーネル- SLACピクセルアレイ検出器（CSPAD）などの敏感な検出器6を 、損傷する可能性がアクションリング。このような混合物は、低い相転移温度を有するような短鎖脂質（9.7 MAGまたはMAG 7.9）と9.9 MAGサンプルの滴定は、この問題を軽減します。ここでは、7.9 MAGで9.9 MAGで構成されるLCPの滴定を記述する。短鎖のMAG（9.7 MAG、7.9 MAG など）を結晶化するために使用されるシリアル結晶学データは、周囲圧力で収集された場合、ステップ5.11において滴定が依然として必要とされているが、ときにそれがために使用さ元のLCPホスト脂質を用いて行うことができます結晶。 データ収集の開始前に約1時間、20℃のインキュベーターからサンプルでシリンジを取り外します。 結晶化条件の似た結晶外観との類似性に基づいて、試料の統合のための2-4シリンジを選択します。 厳選されたシリンジからシールパラフィルムを除去します。 削除します注射器のカプラーとは、最初に選択された注射器にきれいなリムーバブルニードル（ゲージ26S）を添付します。ゆっくり、ゆっくりとマイクロチューブに針を通して沈殿剤を絞り出すために前方プランジャーを押してください。このステップでは、プランジャーに高い圧力を適用することは、サンプルの部分的または完全な損失につながる、沈殿剤溶液と一緒に結晶を含んだLCPの一部を取り出す可能性があるため、このステップでは注意してください。 沈殿剤のほとんどが削除され、LCPが針入り口に蓄積してきたときに、プランジャを停止します。 他の選択された注射器と繰り返しステップ5.4から5.5まで。 結果として得られるLCPのサンプルを統合するには、クリーンカプラを介して一緒に2つのシリンジを接続します。 別の注射器の1から試料全体を転送するために、1つのシリンジにプランジャーを押し下げます。 空のシリンジを外します。 繰り返し、二から四前から結晶を含んだLCP材料のすべてを統合するために5.7から5.9の手順1シリンジに注射器を-selected。できるだけ多くの沈殿剤を削除します。 空のシリンジに7.9 MAGまたは元の短鎖のMAGホスト脂質の〜5μlを添加します。シリンジカプラを介して連結サンプルでシリンジにこの注射器を接続し、代わりにシリンジプランジャーを押し下げることによって混合します。すべての残液が吸収され、均一で透明なLCPが形成されるまで繰り返します。滴定後のLCPの最終量は、過剰な沈殿剤およびその組成物の体積に応じて20から35μlに変化させることができます。 1シリンジ内に全体の混合LCPのサンプルを移動し、空のシリンジを外します。 微結晶の6キャラクタリゼーション連結サンプルでシリンジにLCP-インジェクタローディング針（ポイントスタイル3、ゲージ22、長さが1インチ）を取り付けます。 慎重にガラススライド上にLCPサンプルの〜1μLを取り出し、ガラスカバースリップでそれをカバーしています。静かに押してくださいサンドイッチにカバースリップサンプル。 明視野照明とクロス偏光板を使用して、可能な限り最高の倍率（典型的には100倍）でステレオ顕微鏡下でLCPのサンプルの画像を撮影します。可能な場合は、サンプル中のタンパク質微結晶の存在を確認するために、UV蛍光顕微鏡及び（キラル結晶の二次非線形イメージング）SONICC 17イメージャーを使用して追加の画像を撮影します。 結晶の大きさと密度10を推定します。データ収集実験のための理想的な結晶密度は、結晶の大きさ、X線ビームの直径及びLCPストリームの直径に依存し、約10〜40％の結晶ヒット率をもたらすはずです。 結晶密度の7調整注：ステップ6.4で見つかった結晶密度が高すぎる場合は、複数の結晶ヒットの大きな割合で、その結果、結晶が最適化するために、以下の手順以下に希釈する必要がありますデータ収集のためのサンプル。結晶密度は、全ての調製したサンプルで効率的なデータ収集のために低すぎるとLCPでMP結晶を濃縮するための信頼できる方法がないため、その後の結晶成長条件は、再最適化されるべきです。 ニートLCPの必要量を調製することは希釈する必要がある結晶を元のサンプルのLCP組成（同じ脂質および沈殿剤）を模倣することによって希釈するために使用されます。 1シリンジにすべてきちんとLCPを移動します。空のシリンジを外したが接続カプラーを残します。 微結晶とLCPのサンプルが含まれている注射器から針を外します。カプラを介してきちんとしたLCPを含むシリンジにサンプルシリンジを接続します。 均質性が達成されるまで、カプラを介して前後にそれを押して注射器の内容を混ぜます。 繰り返しセクション6は、調整された試料中の微結晶の密度を再評価します。 8. LCPインジェクタのロードAND LCP-SFXデータ収集サンプルでシリンジからカプラーを外し、注射器に1「ローディング針を取り付けます。 LCPインジェクタのリザーバーにサンプルの20から40μLを移します。 試料室18内にLCPインジェクタを挿入する注入器を起動し、流量を調整し、LCP-SFXデータを収集します。 LCP 9.設立可溶性のタンパク質結晶注：このようなLCPのような粘性の高いメディアを、使用して、可溶性タンパク質の結晶の配信のために1が劇的シリアル結晶学実験でタンパク質の消費量を減少させることを可能にします。これらの手順では、LCP中の可溶性タンパク質の結晶を組み込む方法について説明します。結晶は、任意の技術によって得られた結晶懸濁液の形態で一緒に連結し、必要に応じて濾過することができます。 約百分の10から40までの結晶ヒット率を確保するために、懸濁液中に結晶密度を調整します。 Tエスト7.9 MAG、9.7 MAGまたは1使用してLCPと沈殿剤溶液の互換​​性：7.9 MAGの1混合物とホスト脂質として9.9 MAGを。 均質なLCPが形成されるまでシリンジミキサーを使用して、ホスト脂質の〜25μlの結晶懸濁液の〜25μlのを混ぜます。 第6節で説明したように結晶サイズや密度を評価するLCPインジェクタにサンプルをロードし、セクション8に記載されているようにデータを収集します。