Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie
Summary
We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.
Abstract
Membraaneiwitten (MPS) zijn essentiële onderdelen van celmembranen en primaire drug targets. Rationele drug design is gebaseerd op een nauwkeurige structurele informatie, meestal verkregen door kristallografie; MPs echter moeilijk te kristalliseren. Recente vooruitgang in MP structurele bepaling heeft sterk geprofiteerd van de ontwikkeling van de lipide kubieke fase (LCP) kristallisatie methoden, die levert doorgaans goed voor buigen, maar vaak kleine kristallen die last hebben van straling schade tijdens de traditionele kristallografische het verzamelen van gegevens bij synchrotron bronnen. De ontwikkeling van de nieuwe generatie X-ray vrije-electron laser (XFEL) bronnen die extreem heldere femtoseconde pulsen heeft ingeschakeld verzameling kamertemperatuur gegevens van microkristallen met geen of verwaarloosbare stralingsschade. Onze recente inspanningen combineren LCP technologie seriële femtoseconde kristallografie (LCP-SFX) hebben geleid tot hoge resolutie structuren van verschillende menselijke G-eiwit gekoppelde receptoren, which vertegenwoordigen een notoir moeilijk doelwit voor structuur bepalen. In de LCP-SFX techniek wordt LCP aangeworven als matrix voor zowel de groei en levering van MP microkristallen naar het snijpunt van de injector stroom met een XFEL balk kristallografische gegevensverzameling. Er is aangetoond dat LCP-SFX hoofdzaak diffractie resolutie kan verbeteren wanneer slechts sub- 10 urn kristallen beschikbaar zijn, of wanneer het gebruik van kleinere kristallen bij kamertemperatuur diverse problemen van grotere cryocooled kristallen, zoals de accumulatie van defecten te overwinnen, hoge mosaicity en cryocooling artefacten. Toekomstige ontwikkelingen in de X-ray bronnen en de detector technologieën moeten seriële kristallografie zeer aantrekkelijk en bruikbaar is voor de uitvoering niet alleen op XFELs, maar ook op toegankelijker synchrotron faciliteiten te maken. Hier presenteren wij gedetailleerde visuele protocollen voor de voorbereiding, de karakterisering en de levering van microkristallen in LCP voor seriële kristallografie experimenten.Deze protocollen omvatten werkwijzen voor het uitvoeren van kristallisatie-experimenten in injectiespuiten, detecteren en karakteriseren van het kristal monsters optimaliseren kristaldichtheid, loading microkristallijne beladen LCP in de injector en het leveren van het monster op de balk gegevensverzameling.
Introduction
Röntgenkristallografie is de meest succesvolle techniek tot nu toe voor het oplossen atomaire resolutie structuren van membraaneiwitten (MPs). Kristallisatie uit lipide mesofasen, ook bekend als lipide kubische fase (LCP), of meso kristallisatie, is een van de belangrijke ontwikkelingen MP kristallografie dat de hoge-resolutie structuurbepaling van uitdagende doelen is mogelijk zoals G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs ) 1. Recente ontwikkelingen in LCP instrumenten en technologieën hebben deze techniek beschikbaar is voor een grote gemeenschap van structurele biologen over de hele wereld 2 gemaakt. In veel gevallen MP kristallen die zich in LCP te klein om te worden gebruikt zelfs bij geavanceerde microfocus synchrotron faciliteiten, waarbij de monsters met ernstige stralingsschade en achteruitgang voor voldoende signaal met een hoge resolutie kunnen worden verkregen 3.
Een nieuwe benadering van kristallografische dataverzamelingwerd ingeschakeld met de ingebruikname van de eerste X-ray vrije-electron laser (XFEL). De methode is gebaseerd op het principe van "diffractie voor vernietiging", voor het eerst geïntroduceerd in theorie 4 en vervolgens bevestigd experimenteel op biologische monsters op de Linac Coherent Light Source (LCL) 3, 's werelds pionier in hard XFELs. Een XFEL genereert hoge helderheid X-ray pulsen binnen enkele tientallen femtoseconde duur dat buigen van een ongerepte kristallen voordat het eiwit atomen kan bewegen in reactie op stralingsschade. In de eerste experimenten werden microkristallen continu toegevoerd aan de kruising met de XFEL balk in een waterige stroom door een vloeistof injector 5. Deze experimentele opstelling staat bekend als seriële femtoseconde kristallografie (SFX). Het belangrijkste nadeel van vloeibare injectoren voor SFX is hun hoge flux die dientengevolge vereist tientallen tot honderden mg gezuiverd eiwit voor het verzamelen van een volledige dataset. door employing een speciale injector die kan omgaan met de gel-achtige LCP monsters (LCP microextrusion injector) 6, hebben we met succes opgeleverd microkristallen van een aantal verschillende menselijke GPCR's geteeld in een LCP matrix en verkregen hun high-resolution structuren 6-9, met een aanzienlijk verminderd eiwit consumptie onder 0,3 mg per dataset. De injector bestaat uit een reservoir dat kan vasthouden tot 20, 40 of 100 pl kristal beladen LCP en een smal capillair (10-50 pm in diameter) waardoor het monster wordt geëxtrudeerd door toepassing van een hoge druk (tot 10.000 psi) van een hydraulische plunjer met een druk geamplificeerd fase aangedreven door een vloeistof uit een HPLC (high-performance Liquid Chromatography) pomp. De stroom verlaat de LCP capillairmondstuk wordt gestabiliseerd door een parallelle stroom reactief gas (meestal helium of stikstof).
Hier bieden we visuele demonstraties van de stappen die nodig zijn om voor te bereiden en te karakteriseren monsterseen LCP-SFX experiment. Verdere details zijn te vinden in de gepubliceerde protocollen 10. Als voorbeeld zullen we adenosine A2A receptor 11 kan worden en bereid kristallen van dit eiwit in LCP voor de röntgenbron gegevensverzameling via SFX benadering. Terwijl onze protocollen compatibel met elk injector die in staat van streaming LCP voor het verzamelen van gegevens door de seriële kristallografie aan XFEL en synchrotron bronnen, ter illustratie, zullen we de LCP injector in Ref beschreven gebruiken. 6. Geoptimaliseerde neerslag voorwaarden die high-density microkristallen in LCP produceren moeten worden geïdentificeerd door high-throughput screening kristallisatie 12,13 alvorens tot dit protocol. Een typische stroomdiagram van dit protocol wordt weergegeven in figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven protocollen geven een algemeen overzicht van het monster voorbereiding procedure voor een standaard LCP-SFX experimenteren met een LCP injector. Gebaseerd op onze ervaring, het totale bedrag van de definitieve microkristallijne beladen LCP monster dat nodig is voor het verzamelen van een volledige dataset typisch 50-100 gl (Tabel 1, 25-50 pl oorspronkelijke proteïne beladen LCP sample), afhankelijk van de microkristallijne maat , en -dichtheid. Aangezien elk 100 pi gasdichte glazen spuit kan ongeveer 7 ui van LCP in de vorm van een volledig uitgestrekte string goede en zelfs diffusie van het precipitatiemiddel oplossing in de LCP waarborgen, moet ten minste 6:56 monsters injectiespuiten worden voorbereid elke LCP-SFX experiment.
Aangezien het monster wordt geëxtrudeerd door een smalle 20-50 micrometer diameter capillair, is het cruciaal om op ongerechtigheden materiaal in het monster te voorkomen. Stof en vezels die soms in het LCP kan worden geïntroduceerdmonster of precipitatiemiddel oplossingen kan de injector capillaire verstoppen en verhoging van de down-time tijdens het experiment. Daarom is het belangrijk om de lipide en alle oplossingen door een 5 um poriegrootte filter filteren voordat monstervoorbereiding. Eventueel kan een clean room of een draagbare clean room kap worden gebruikt voor de monstervoorbereiding.
Deze protocollen zijn gebaseerd op het gebruik van 9,9 MAG (oleïne) als de gastheer lipide voor MP kristallisatie. Zij zijn echter niet beperkt tot 9,9 MAG en kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere LCP gastheer lipiden en lipide mengsels rekening houdend met de verschillen in de lipidefase gedrag. De meeste van de structuur van MPs gekristalliseerd in LCP werden verkregen via een van de tijdschriften, met 9,9 MAG de meest succesvolle representatieve dusver 15. Het belangrijkste nadeel van het gebruik van 9,9 MAG SFX is de overgang naar lamellaire kristalfase na afkoelen onder 18 ° C, die vaak optreedt wanneer de metingen worden uitgevoerd onder vacuüm. de titratiop 7,9 MAG beschreven in paragraaf 5 van dit protocol biedt een goede oplossing voor dit probleem. In onze ervaring, kristallen weerstaan zo'n titratie zonder nadelige effecten. Indien echter de toevoeging van 7,9 MAG of een korte keten MAG is niet wenselijk, kan de titratie uitgevoerd met 9,9 MAG. In dit geval moet het gas dat de stroom van LCP bij injectie in het vacuüm stabiliseert omschakelbaar van helium stikstof, die de vorming van een kristallijne lipidefase in de meeste monsters kunnen voorkomen ten koste van een minder stabiel monsterstroom.
De gelachtige consistentie van LCP heeft een groot voordeel voor gebruik als een kristal dragermedium, aangezien het aanpassen van de stroomsnelheid kristal in een breed assortiment, geschikt voor seriële kristallografie gegevensverzameling op moderne XFEL en synchrotron bronnen. Passend bij de kristallen stroom met de XFEL pulsherhalingsfrequentie resulteert in een drastische vermindering van kristal verbruik van ordes van grootte compared te vloeistofinjectie. LCP is een geschikt dragermedium voor afgifte niet alleen MP kristallen gegroeid, maar ook om kristallen van oplosbare eiwitten 21. Verschillende alternatieve viskeuze kristal carrier media zijn onlangs geïntroduceerd 22-24, de uitbreiding van het arsenaal aan instrumenten en reagentia voor het uitvoeren van seriële kristallografie experimenten. Bovendien heeft seriële kristallografie met LCP als een kristal aflevermedium aangetoond bij conventionele synchrotron bronnen, althans voor goed buigen van kristallen 24,25. Toekomstige upgrades van synchrotron bronnen die boost X-ray intensiteit door ordes van grootte, evenals verbeteringen in de detector technologieën, zal seriële kristallografie een nog toegankelijker en aantrekkelijker methode om de structuur te bepalen.
LCP-SFX heeft de potentie voor MP structurele bepaling aangetoond. Voor uitdagende biologische systemen (zoals GPCR's of macromoleculaire complexen) waarbij large, diffractie kwaliteit kristallen zijn moeilijk om te groeien, kan LCP-SFX een aantrekkelijk bieden, zo niet de enige, haalbare optie om een atomaire resolutie structuur op te lossen. Met al zijn voordelen, dat wil zeggen, met behulp van LCP als de matrix voor MP kristallisatie en kristal levering, lage eiwitconsumptie, de afwezigheid van stralingsschade, kamertemperatuur verzamelen van gegevens, de mogelijkheden van tijdsopgeloste studies 26,27 en geen kristal oogsten vereiste, LCP- SFX moeten een belangrijke rol spelen in de toekomst van de structurele biologie spelen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidies R01 GM108635 en U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Collaborative Seed Grant Award en NSF STC award 1231306. Wij danken A. Walker voor hulp bij het manuscript voorbereiding.
Materials
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Nu Chek Prep | M239 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Sigma | M7765 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) | Nu Chek Prep | M219 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids | 850534 | Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection |
| Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/mL | Target protein | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | Used to dissolve lipids |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-500ML | Used to wash syringes |
| Eleven 100 mL Hamilton gas-tight syringes without needles | Hamilton | 7656-01 | For LCP preparation |
| Eight syringe couplers | Hamilton | SKU 209526 | For LCP preparation |
| Removable flat-tipped needle | Hamilton | 7804-01 | For LCP dispensing |
| Parafilm | Parafilm | M', 250' x 2" | Used for syringe sealing |
| Lint free lens cleaning tissues | Fisher | NC9592151 | |
| Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 mL, Durapore 5 µm | Millipore | UFC3 0SV 00 | Used for filtering of precipitant solutions and lipids |
| Microscope slides, 1 inch x 3 inch | GoldSeal | 3010 | |
| Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol | VWR | 89094-640 | These are used to clean the syringes, needles and coupler. Methanol is used first, then water. |
| Gloves | Microflex | XC-310-L | For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers |
| Safety glasses | |||
| Pressurized air cans | Office Depot (Dust-Off) | 527494 | For syringe cleaning |
| Dry block heater with a digital temperature controller | Fisher | 11-720-10BQ | Used for thawing lipids |
| Benchtop Centrifuge | Fisher | 05-413-340 | Spinning down solutions |
| Clean Room Mini – 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter | Sentry Air Systems, Inc. | SS-112-PCR | Cleaning sample preparation |
| Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer | Nikon | SMZ1500 | Crystal density check |
| UV microscope | JAN Scientific | UVEX-P | Optional, for crystal imaging purposes |
| SHG imager | Formulatrix | SONICC | Optional, for crystal imaging purposes |
References
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505 (2008).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat Commun. 5, 3309 (2014).
- Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).
- Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).
- Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Liu, W., et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science. 337 (6091), 232-236 (2012).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J Vis Exp. (49), (2011).
- Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase. Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, (2009).
- Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. Monoolein: a magic lipid?. Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).
- James, D. . Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , 1-126 (2015).
- Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
- Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2, 168-176 (2015).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. 513, 261-265 (2014).
