הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי
Summary
We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.
Abstract
חלבוני ממברנה (MPS) הם מרכיבים חיוניים של קרום תא ויעדי תרופה עיקריים. תכנון תרופות Rational מסתמך על מידע מבני מדויק, בדרך כלל מתקבל על ידי קריסטלוגרפיה; אולם חברי פרלמנט קשים להתגבש. התקדמות אחרונות נחישות מבניים MP הרוויחה מאוד מפיתוח השלב מעוקב lipidic (LCP) שיטות התגבשות, אשר בדרך כלל תשואה היטב diffracting, אבל לעתים קרובות גבישים קטנים אשר סובלים מנזקי הקרינה במהלך איסוף הנתונים crystallographic מסורתי מקורות synchrotron. פיתוח לייזר אלקטרונים חופשיים מהדור החדש רנטגן (XFEL) מקורות המייצרים פולסים femtosecond בהיר מאוד איפשר איסוף נתונים בטמפרטורת החדר מן microcrystals עם שום או נזקי קרינה זניחה. המאמצים האחרונים שלנו בשילוב הטכנולוגיה LCP עם קריסטלוגרפיה femtosecond סדרתי (LCP-SFX) גרמו מבנים ברזולוציה גבוהה של כמה קולטנים האדם G מצמידים חלבון, which מהווה יעד קשה לשמצה קביעת מבנה. בטכניקה LCP-SFX, LCP מגויסת כמטריצה הן צמיחה ואספקה של microcrystals MP לצומת של הנחל מזרק עם קרן XFEL לאספת נתונים crystallographic. הוכח כי LCP-אפקטים מיוחדים יכולים לשפר את הרזולוציה העקיפה מהותי כאשר רק גבישים תת-10 מיקרומטר זמינים, או כאשר השימוש של גבישים קטנים יותר בטמפרטורת חדר יכול להתגבר על בעיות שונות הקשורות גבישי cryocooled גדולים יותר, כמו הצטברות של פגמים, mosaicity גבוהה וחפצי cryocooling. התקדמות בעתיד במקורות רנטגן וטכנולוגיות גלאי צריכה לעשות קריסטלוגרפיה סדרה אטרקטיבית מאוד מבחינה מעשית ליישום לא רק XFELs, אלא גם beamlines סינכרוטרון הנגיש יותר. כאן אנו מציגים פרוטוקולים חזותיים מפורטים להכנה, אפיון מסירת microcrystals ב LCP לניסויים קריסטלוגרפיה סדר.פרוטוקולים אלה כוללים שיטות לביצוע ניסויי התגבשות מזרקים, גילוי ואפיון דגימות הקריסטל, אופטימיזציה צפיפות קריסטל, טעינת LCP העמוס microcrystal לתוך מכשיר המזרק ושולחי המדגם אל הקורה לאספת נתונים.
Introduction
רנטגן קריסטלוגרפיה היא הטכניקה המוצלחת ביותר עד כה לפתרון מבנים אטומי ברזולוציה של חלבונים בממברנה (חברי פרלמנט). התגבשות מ mesophases lipidic, הידוע גם בשם השלב מעוקב lipidic (LCP), או התגבשות טווינה, מייצג את אחד מההתפתחויות העיקריות קריסטלוגרפיה MP כי אפשרה קביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של מטרות מאתגרות כגון חלבון בשילוב קולטנים G (GPCRs 1). הפיתוחים האחרונים בכלים וטכנולוגיות LCP הפכו טכניקה זו לרשות קהילה גדולה של ביולוגים מבניים ברחבי העולם 2. עם זאת, במקרים רבים הגבישים MP כי הטופס LCP הם קטנים מדי כדי לשמש אפילו המתקדמת ביותר beamlines סינכרוטרון microfocus, שבו דגימות סובלים מנזקי הקרינה חמורה והידרדרות לפני האות חזקה מספיק ברזולוציה גבוהה ניתן להשיג 3.
גישה חדשה לאיסוף נתונים crystallographicהתאפשרה עם המזמין של רנטגן אלקטרונים חופשיים לייזר (XFEL) הראשון. השיטה מבוססת על העיקרון של "עקיף לפני החורבן", הוצג לראשונה באופן תיאורטי 4 ולאחר מכן ניסוי אשר על דגימות ביולוגיות על מקור אור Linac קוהרנטית (LCLS) 3, החלוץ בעולם XFELs הקשה. XFEL מייצר פולסים רנטגן בהירות גבוהה בתוך כמה עשרות משך femtosecond כי diffract מגביש וטהור לפני אטומים חלבון יכול לנוע בתגובה לנזקי קרינה. בניסויים הראשוניים, microcrystals סופקו באופן רציף עד לצומת עם קורה XFEL בזרם מימי המיוצר על ידי מזרק נוזל 5. התקנה ניסיונית תופעה זו ידועה בשם קריסטלוגרפיה femtosecond סדרתי (SFX). החסרון העיקרי באמצעות מרססים נוזלים SFX הוא קצב הזרימה הגבוה שלהם, אשר כתוצאה מכך דורש עשרות עד מאה מיליגרם של חלבון מטוהר לאיסוף במערך שלם. על ידי EMPloying מזרק מיוחד שיכול לטפל דגימות LCP דמוי ג'ל (מזרק microextrusion LCP) 6, העברנו microcrystals בהצלחה של GPCRs אדם שונים הגדלים מטריצה LCP וקיבלנו מבנים ברזולוציה גבוהה שלהם 6 – 9, עם חלבון מופחת משמעותית צריכה תחת 0.3 מ"ג בכל מערך נתונים. ההזרקה מורכבת ממאגר שיכול להכיל עד 20, 40 או 100 μl של LCP קריסטל-לאדן נימי צר (10-50 מיקרומטר קוטר) שדרכו המדגם הנמתח על ידי יישום של לחץ גבוה (עד 10,000 psi) מתוך בוכנה הידראולית עם במה מוגברת לחץ, מונעת על ידי נוזל משאבת HPLC (בעל ביצועים גבוהים נוזלת כרומטוגרפיה). זרם LCP יציאת זרבובית הנימים הוא התייצב על ידי זרימה מקבילה של גז nonreactive (בדרך כלל הליום או חנקן).
כאן אנו מספקים הפגנות חזותיות של הצעדים הנדרשים כדי להכין ולאפיין דגימותעבור ניסוי LCP-SFX. ניתן למצוא פרטים נוספים בפרוטוקולים שפורסמו 10. כדוגמה, נשתמש אדנוזין קולט 2A 11 ולהכין גבישים של החלבון הזה ב LCP לאיסוף נתונים רנטגן שימוש בגישה SFX. בעוד הפרוטוקולים שלנו עולים בקנה אחד עם כל מזרק מסוגל הזרמת LCP עבור איסוף נתונים על ידי קריסטלוגרפיה סדר במקורות XFEL ו synchrotron, להמחשה, נשתמש מזרק LCP המתואר Ref. 6. תנאים נמהרים אופטימליים המייצרים microcrystals צפיפות גבוהה LCP צריכים להיות מזוהים על ידי התגבשות תפוקה גבוהה הקרנת 12,13 לפני שתמשיך בפרוטוקול זה. תרשים זרימה טיפוסי עבור פרוטוקול זה מוצג באיור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים המתוארים כאן מתארים באופן כללי של נוהל הכנת מדגם לניסוי LCP-SFX רגיל עם מזרק LCP. בהתבסס על הניסיון שלנו, את הסכום הכולל של מדגם LCP microcrystal-לאדן הסופי הנדרש לאיסוף בסיס נתונים מלאים הוא בדרך כלל 50-100 μl (טבלת 1; 25-50 μl של מדגם LCP חלבון עמוס ראשוני), בהתאם לגודל microcrystal , איכות וצפיפות. מאז כל 100 מזרק μl גז חזק זכוכית יכול להכיל כ 7 μl של LCP בצורת מחרוזת פרושים עד הסוף כדי להבטיח ראוי ואף דיפוזיה של הפתרון הנמהר לתוך LCP, לפחות ארבעה עד שבע דגימות ב מזרקים צריכות להיות מוכנות כל ניסוי LCP-SFX.
מאז המדגם נמתח דרך מיקרומטר 20-50 צר נימי קוטר, חשוב להימנע מכל חומר חלקיקי זרים במדגם. Dusts ו סיבים שיכולים להיות מוצג מדי פעם LCPפתרונות מדגמים או נמהרים שעלולים לסתום את נימי המזרק ולהגדיל את האמת נחלשה במהלך הניסוי. לכן, חשוב לסנן את השומנים וכל הפתרונים דרך פילטר נקבובי 5 מיקרומטר לפני הכנת דגימות. לחלופין, חדר נקי או ברדס בחדר נייד נקי יכול לשמש להכנת מדגם.
פרוטוקולים אלה מבוססים על שימוש 9.9 MAG (monoolein) כמו השומנים המארחים להתגבשות MP. הם, לעומת זאת, אינם מוגבלים 9.9 MAG וניתן להתאים בקלות לכל שומנים מארחים LCP אחרים או תערובות שומנים לאחר שהובא בחשבון את ההבדלים בהתנהגות שלב השומנים. מרבית המבנים של חברי פרלמנט התגבש LCP התקבלו באמצעות לאחד מהעיתונים, עם 9.9 MAG להיות הנציג המצליח ביותר עד כה 15. החסרון העיקרי של שימוש 9.9 MAG עבור SFX הוא המעבר שלה לשלב גביש שבשבת בקירור מתחת ל -18 מעלות צלזיוס, אשר לעתים קרובות מתרחשת כאשר רכישת הנתונים מתבצעת בחלל ריק. titratiעל עם 7.9 תאר MAG בסעיף 5 של פרוטוקול זה מספק פתרון טוב לבעיה זו. מניסיוננו, קריסטלים לעמוד טיטרציה כזה ללא כל תופעות לוואי. אם, לעומת זאת, התוספת של 7.9 MAG או אחר MAG קצר ב"שרשרת אינה רצויה, טיטרציה יכול להתבצע עם 9.9 MAG. במקרה זה, הגז אשר מייצב את זרימת LCP במהלך ההזרקה לתוך ואקום יש משיטת הליום חנקן, אשר יכול למנוע היווצרות של שלב השומנים גבישי ברוב דגימות, על חשבון בעל זרימת מדגם יציבה פחות.
העקביות דמוית ג'ל של LCP יש יתרון גדול לשימוש כמדיום המוביל קריסטל, שכן הוא מאפשר התאמה של שער זרימת קריסטל על פני מגוון רחב, המתאים איסוף נתוני קריסטלוגרפיה סדרה במקורות XFEL ו synchrotron מודרניות. התאמת קצב הזרימה קריסטל עם תוצאות החזרה הדופקות XFEL ב לירידה דרמטית בצריכת קריסטל לפי סדר הגודל גompared הזרקת נוזל. LCP הוא מדיום מוביל מתאים למסירה לא רק של גבישי MP גדלו בו, אלא גם עבור גבישים של חלבונים מסיסים 21. תקשורת מובילה קריסטל צמיגת מספר חלופית לאחרונה הוכנסה 22 – 24, הרחבת הארסנל של כלים ריאגנטים לביצוע ניסויים קריסטלוגרפיה סדר. יתר על כן, קריסטלוגרפיה סדרה עם LCP כמדיום משלוח קריסטל הודגמה במקורות סינכרוטרון קונבנציונליים, לפחות עבור היטב diffracting גבישי 24,25. שדרוג עתידי של מקורות synchrotron להגביר עוצמת רנטגן לפי סדרי גודל, כמו גם שיפורים בטכנולוגיות גלאי, יגרום קריסטלוגרפיה סדרתי שיטה עוד יותר לנגיש ואטרקטיבי עבור קביעת מבנה.
LCP-SFX הוכיח העצמה שלה לקביעה מבנית MP. עבור מערכות ביולוגיות מאתגרות (כגון GPCRs או מתחמי macromolecular) איפה אניarge, גבישים באיכות עקיפה קשים לגדול, LCP-SFX עשויה לספק אטרקטיבית, אם לא האופציה היחידה, מעשית לפתור מבנה ברזולוציה אטומי. עם כל היתרונות שלה, כלומר, באמצעות LCP כמו מטריקס להתגבשות MP ומסיר קריסטל, צריכת חלבון נמוכה, עדר ניזקי קרינה, איסוף נתונים בטמפרטורת חדר, אפשרויות של מחקרי זמן נפתר 26,27 ואין דרישת קצירת גביש, LCP- SFX צריך לשחק תפקיד חשוב בעתיד של ביולוגיה מבנית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01 GM108635 ו U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU שיתופית זרע גרנט פרס ו- NSF STC הפרס 1231306. אנו מודים א ווקר לסיוע בהכנת כתב היד.
Materials
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Nu Chek Prep | M239 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Sigma | M7765 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) | Nu Chek Prep | M219 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids | 850534 | Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection |
| Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/mL | Target protein | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | Used to dissolve lipids |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-500ML | Used to wash syringes |
| Eleven 100 mL Hamilton gas-tight syringes without needles | Hamilton | 7656-01 | For LCP preparation |
| Eight syringe couplers | Hamilton | SKU 209526 | For LCP preparation |
| Removable flat-tipped needle | Hamilton | 7804-01 | For LCP dispensing |
| Parafilm | Parafilm | M', 250' x 2" | Used for syringe sealing |
| Lint free lens cleaning tissues | Fisher | NC9592151 | |
| Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 mL, Durapore 5 µm | Millipore | UFC3 0SV 00 | Used for filtering of precipitant solutions and lipids |
| Microscope slides, 1 inch x 3 inch | GoldSeal | 3010 | |
| Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol | VWR | 89094-640 | These are used to clean the syringes, needles and coupler. Methanol is used first, then water. |
| Gloves | Microflex | XC-310-L | For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers |
| Safety glasses | |||
| Pressurized air cans | Office Depot (Dust-Off) | 527494 | For syringe cleaning |
| Dry block heater with a digital temperature controller | Fisher | 11-720-10BQ | Used for thawing lipids |
| Benchtop Centrifuge | Fisher | 05-413-340 | Spinning down solutions |
| Clean Room Mini – 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter | Sentry Air Systems, Inc. | SS-112-PCR | Cleaning sample preparation |
| Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer | Nikon | SMZ1500 | Crystal density check |
| UV microscope | JAN Scientific | UVEX-P | Optional, for crystal imaging purposes |
| SHG imager | Formulatrix | SONICC | Optional, for crystal imaging purposes |
References
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505 (2008).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat Commun. 5, 3309 (2014).
- Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).
- Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).
- Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Liu, W., et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science. 337 (6091), 232-236 (2012).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J Vis Exp. (49), (2011).
- Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase. Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, (2009).
- Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. Monoolein: a magic lipid?. Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).
- James, D. . Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , 1-126 (2015).
- Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
- Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2, 168-176 (2015).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. 513, 261-265 (2014).
