Preparazione e consegna di microcristalli proteina nella fase cubica lipidica per Serial femtosecondi Cristallografia
Summary
We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.
Abstract
Le proteine di membrana (MP) sono componenti essenziali delle membrane cellulari e bersagli farmacologici primari. drug design razionale si basa su precise informazioni strutturali, tipicamente ottenuta mediante cristallografia; tuttavia i parlamentari sono difficili da cristallizzare. I recenti progressi nella MP determinazione strutturale ha beneficiato ampiamente lo sviluppo di metodi lipidiche fase cubica (LCP) di cristallizzazione, che in genere producono ben diffrazione, ma spesso piccoli cristalli che soffrono di danni da radiazioni durante la raccolta tradizionale dei dati cristallografica a fonti di sincrotrone. Lo sviluppo di laser a elettroni liberi a raggi X di nuova generazione (XFEL) fonti che producono impulsi a femtosecondi molto luminosi ha permesso camera di raccolta dati di temperatura da microcristalli con nessuna o danni da radiazioni trascurabile. I nostri recenti sforzi di combinare la tecnologia LCP con seriale cristallografia a femtosecondi (LCP-SFX) hanno portato a strutture ad alta risoluzione di diversi G recettori accoppiati alla proteina umana, which rappresentare un bersaglio notoriamente difficile per la determinazione della struttura. Nella tecnica LCP-SFX, LCP viene reclutato come matrice per la crescita e la consegna di microcristalli MP all'intersezione del torrente iniettore con un fascio XFEL per la raccolta dati cristallografica. È stato dimostrato che LCP-SFX può migliorare sostanzialmente la risoluzione di diffrazione quando solo sotto-10 micron cristalli sono disponibili, o quando l'uso dei cristalli più piccoli a temperatura ambiente può superare vari problemi connessi con cristalli cryocooled più grandi, come l'accumulo di difetti, alta mosaicity e artefatti cryocooling. progressi futuri in sorgenti di raggi X e le tecnologie rivelatore deve fare cristallografia di serie molto interessante e praticabile per l'attuazione non solo a XFELs, ma anche a linee di luce di sincrotrone più accessibili. Qui vi presentiamo protocolli visive dettagliate per la preparazione, la caratterizzazione e la consegna di microcristalli in LCP per esperimenti di cristallografia seriali.Questi protocolli includono metodi per condurre esperimenti di cristallizzazione in siringhe, rilevare e caratterizzare i campioni cristallo, ottimizzando la densità di cristallo, caricando microcrystal LCP carico nel dispositivo iniettore ed erogare il campione alla trave per la raccolta dei dati.
Introduction
Cristallografia a raggi X è la tecnica di maggior successo fino ad oggi per risolvere le strutture atomiche risoluzione delle proteine di membrana (MP). La cristallizzazione da mesophases lipidiche, noto anche come fase cubica lipidica (LCP), o in meso cristallizzazione, rappresenta uno dei più importanti sviluppi in MP cristallografia che ha permesso la determinazione della struttura ad alta risoluzione di obiettivi impegnativi come ad esempio G recettori accoppiati a proteine (GPCR ) 1. Recenti progressi nella strumenti e le tecnologie LCP hanno fatto di questa tecnica a disposizione di una vasta comunità di biologi strutturali in tutto il mondo 2. Tuttavia, in molti casi i cristalli che si formano in MP LCP sono troppo piccole per essere utilizzato anche a più avanzata beamlines microfocus sincrotrone, dove i campioni soffrono di danni da radiazione gravi e deterioramento prima del segnale sufficiente ad alta risoluzione può essere ottenuta 3.
Un nuovo approccio per la raccolta dei dati cristallograficaè stato abilitato con la messa in servizio del laser a elettroni liberi a raggi X prima (XFEL). Il metodo si basa sul principio della "diffrazione prima della distruzione", introdotto teoricamente 4 e poi confermata sperimentalmente su campioni biologici durante il Linac Coherent Light Source (LCLs) 3, pioniere del mondo in XFELs duri. Un XFEL genera ad alta luminosità impulsi di raggi X all'interno di poche decine di femtosecondi durata che diffract da un cristallo incontaminato prima che gli atomi della proteina possono muoversi in risposta a danni da radiazioni. Negli esperimenti iniziali, microcristalli stati continuamente forniti fino all'intersezione con il fascio XFEL in una corrente acquosa prodotta da un iniettore liquido 5. Questo apparato sperimentale è conosciuta come la cristallografia a femtosecondi di serie (SFX). Il principale svantaggio nell'utilizzo iniettori liquidi per SFX è la loro elevata portata, che richiede pertanto decine a centinaia di milligrammi di proteina purificata per la raccolta di un set di dati completo. Con employing un iniettore speciale in grado di gestire i campioni LCP gel-like (LCP microestrusione iniettore) 6, abbiamo consegnato con successo microcristalli di diversi GPCR umani diversi coltivate in una matrice LCP e ottenuto le loro strutture ad alta risoluzione 6 – 9, con una proteina significativamente ridotto il consumo a meno di 0,3 mg per set di dati. L'iniettore è costituito da un serbatoio che può contenere fino a 20, 40 o 100 ml di LCP cristallo carichi ed un capillare stretto (10-50 micron di diametro) attraverso cui il campione viene estrusa mediante applicazione di alta pressione (fino a 10.000 psi) da un pistone idraulico con una fase di pressione amplificata, guidato da un liquido da una pompa HPLC (cromatografia liquida ad alta prestazione). Il flusso di LCP uscita dell'ugello capillare viene stabilizzata da un flusso parallelo di gas non reattivo (tipicamente elio o azoto).
Qui forniamo dimostrazioni visive dei passaggi necessari per preparare e caratterizzare i campioniper un esperimento LCP-SFX. Ulteriori dettagli possono essere trovati nei protocolli pubblicati 10. Come esempio, useremo adenosina Un recettore 2A 11 e preparare cristalli di questa proteina in LCP per la raccolta di dati a raggi X utilizzando approccio SFX. Mentre i nostri protocolli sono compatibili con qualsiasi iniettore in grado di streaming LCP per la raccolta dei dati da parte di cristallografia seriale fonti XFEL e sincrotrone, a scopo illustrativo, useremo l'iniettore LCP descritto nella Ref. 6. condizioni precipitanti ottimizzate che producono microcristalli ad alta densità in LCP dovrebbero essere identificate da high-throughput screening cristallizzazione 12,13 prima di procedere con questo protocollo. Un diagramma di flusso tipico per questo protocollo è mostrato in Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli descritti qui forniscono un quadro generale della procedura di preparazione del campione per un esperimento standard di LCP-SFX con un iniettore LCP. Sulla base della nostra esperienza, la quantità totale del campione LCP microcrystal carichi finale richiesto per raccogliere un set di dati completo è tipicamente 50-100 microlitri (Tabella 1; 25-50 ml di campione iniziale LCP proteina-carico), a seconda delle dimensioni microcrystal , la qualità e la densità. Poiché ogni 100 microlitri siringa di vetro a tenuta di gas può ospitare circa 7 ml di LCP nella forma di una stringa completamente estesa per garantire la corretta e perfino diffusione della soluzione precipitante nella LCP, almeno quattro a sette campioni in siringhe devono essere preparati per ogni esperimento LCP-SFX.
Poiché il campione viene estrusa attraverso una stretta 20-50 micron di diametro capillare, è fondamentale per evitare qualsiasi materiale particolato estraneo nel campione. Le polveri e fibre che potrebbero essere occasionalmente introdotti nel LCPsoluzioni campione o precipitanti possono intasare il capillare dell'iniettore e aumentare il down-tempo durante l'esperimento. Pertanto, è importante filtrare i lipidi e tutte le soluzioni attraverso un filtro pori 5 micron prima di preparare campioni. Facoltativamente, una camera pulita o cappuccio portatile stanza pulita può essere utilizzato per la preparazione del campione.
Questi protocolli si basano sull'utilizzo di 9.9 MAG (monoolein) come lipidi host per MP cristallizzazione. Essi, tuttavia, non sono limitati a 9,9 MAG e possono essere facilmente adattate ad altri lipidi ospitanti LCP o miscele lipidiche dopo aver tenuto conto delle differenze nel comportamento di fase lipidica. La maggior parte delle strutture di parlamentari cristallizzate in LCP sono stati ottenuti utilizzando una delle riviste, con 9,9 MAG essere il rappresentante di maggior successo finora 15. Lo svantaggio principale di utilizzare 9,9 MAG per SFX è il suo passaggio alla fase cristallina lamellare sul raffreddamento sotto i 18 ° C, che spesso si verifica quando l'acquisizione dei dati viene eseguita nel vuoto. il titratiavanti con 7.9 MAG descritto nella Sezione 5 del presente protocollo prevede una buona soluzione a questo problema. Nella nostra esperienza, i cristalli resistono ad una tale titolazione senza effetti negativi. Se, tuttavia, l'aggiunta di 7,9 MAG o un'altra MAG catena corta non è auspicabile, la titolazione può essere eseguita con 9,9 MAG. In questo caso, il gas che stabilizza il flusso di LCP durante l'iniezione nel vuoto deve essere commutato da elio azoto, che può impedire la formazione di una fase lipidica cristallina nella maggior parte dei campioni, a scapito di avere un flusso campione meno stabile.
La consistenza gelatinosa di LCP ha un grande vantaggio per uso come supporto informatico cristallo, in quanto permette la regolazione della portata di cristallo in una vasta gamma, adatti per la raccolta cristallografia seriale moderni fonti XFEL e sincrotrone. Adattamento del flusso di cristallo con l'impulso XFEL risultati dei tassi di ripetizione in drastica riduzione nel consumo di cristallo di ordini di grandezza compared a iniezione di liquido. LCP è un mezzo trasportatore adatto a conseguire non solo i cristalli MP coltivati in esso, ma anche per i cristalli di proteine solubili 21. Diversi supporti informatici cristallo viscosi alternativi sono stati recentemente introdotti 22 – 24, estendendo l'arsenale di strumenti e reagenti per lo svolgimento di esperimenti di cristallografia seriali. Inoltre, la cristallografia seriale con LCP come mezzo di consegna cristallo è stata dimostrata con sincrotrone convenzionali, almeno per ben diffrazione cristalli 24,25. I futuri aggiornamenti delle fonti di sincrotrone che aumentano l'intensità dei raggi X da ordini di grandezza, così come i miglioramenti nelle tecnologie del rivelatore, renderanno cristallografia seriale un metodo ancora più accessibile e attraente per la determinazione della struttura.
LCP-SFX ha dimostrato la sua potenza per MP determinazione strutturale. Per i sistemi biologici impegnativi (come GPCR o complessi macromolecolari) dove Large, cristalli di diffrazione di qualità sono difficili da coltivare, LCP-SFX può fornire un attraente, se non l'unica opzione, valida per risolvere una struttura risoluzione atomica. Con tutti i suoi vantaggi, vale a dire, usando LCP come matrice per MP cristallizzazione e la consegna di cristallo, un basso consumo di proteine, assenza di danni da radiazioni, camera di raccolta dei dati di temperatura, le possibilità di studi risolte nel tempo 26,27 e nessun requisito di cristallo di raccolta, LCP- SFX dovrebbe svolgere un ruolo importante nel futuro della biologia strutturale.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede R01 GM108635 e U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Seed Collaborative di Grant Award e NSF STC premio 1231306. Ringraziamo A. Walker per l'assistenza con la preparazione del manoscritto.
Materials
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Nu Chek Prep | M239 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Sigma | M7765 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) | Nu Chek Prep | M219 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids | 850534 | Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection |
| Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/mL | Target protein | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | Used to dissolve lipids |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-500ML | Used to wash syringes |
| Eleven 100 mL Hamilton gas-tight syringes without needles | Hamilton | 7656-01 | For LCP preparation |
| Eight syringe couplers | Hamilton | SKU 209526 | For LCP preparation |
| Removable flat-tipped needle | Hamilton | 7804-01 | For LCP dispensing |
| Parafilm | Parafilm | M', 250' x 2" | Used for syringe sealing |
| Lint free lens cleaning tissues | Fisher | NC9592151 | |
| Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 mL, Durapore 5 µm | Millipore | UFC3 0SV 00 | Used for filtering of precipitant solutions and lipids |
| Microscope slides, 1 inch x 3 inch | GoldSeal | 3010 | |
| Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol | VWR | 89094-640 | These are used to clean the syringes, needles and coupler. Methanol is used first, then water. |
| Gloves | Microflex | XC-310-L | For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers |
| Safety glasses | |||
| Pressurized air cans | Office Depot (Dust-Off) | 527494 | For syringe cleaning |
| Dry block heater with a digital temperature controller | Fisher | 11-720-10BQ | Used for thawing lipids |
| Benchtop Centrifuge | Fisher | 05-413-340 | Spinning down solutions |
| Clean Room Mini – 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter | Sentry Air Systems, Inc. | SS-112-PCR | Cleaning sample preparation |
| Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer | Nikon | SMZ1500 | Crystal density check |
| UV microscope | JAN Scientific | UVEX-P | Optional, for crystal imaging purposes |
| SHG imager | Formulatrix | SONICC | Optional, for crystal imaging purposes |
References
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