JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Published: September 20, 2016
doi:
10.3791/54463
, ,
1The Bridge Institute,University of Southern California, 2Department of Chemistry,University of Southern California, 3School of Molecular Sciences, Center for Applied Structural Discovery at the Biodesign Institute,Arizona State University

Summary

We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.

Abstract

Мембранные белки (депутаты) являются важными компонентами клеточных мембран и первичных мишеней для лекарственных средств. Рациональное конструирование лекарственного средства основывается на точной структурной информации, как правило, полученные кристаллографии; Однако депутаты трудно кристаллизуются. Недавний прогресс в структурной определении МП большую пользу от развития липидных кубической фазы (LCP) методов кристаллизации, которые обычно дают хорошо дифрагируя, но часто небольшие кристаллы, которые страдают от радиационных повреждений во время традиционного кристаллографической сбора данных на источниках синхротронного. Разработка нового поколения рентгеновского лазера на свободных электронах (XFEL) источников, которые производят чрезвычайно яркие фемтосекундных импульсов позволило сбор данных Температура воздуха в помещении от микрокристаллов с отсутствием или незначительным повреждением излучения. Наши недавние усилия в объединении технологии LCP с последовательным фемтосекундного кристаллографии (LCP-SFX) привели к структурам с высокой разрешающей способностью нескольких человеческих G-белком рецепторов, шHICH представляют собой заведомо трудную мишень для определения структуры. В методике LCP-SFX, LCP набирается в качестве матрицы для роста как и поставки микрокристаллов MP до пересечения потока форсунки с XFEL пучком для кристаллографической сбора данных. Было показано, что ЖКП-SFX может существенно улучшить разрешение дифракции, когда только к югу от 10 мкм кристаллы доступны, или когда использование более мелких кристаллов при комнатной температуре может преодолеть различные проблемы, связанные с более крупными cryocooled кристаллов, такие как накопление дефектов, высокая мозаичность и cryocooling артефакты. Будущие достижения в области рентгеновских источников и технологий детектор должен сделать последовательный кристаллография весьма привлекательным и практически для реализации не только на XFELs, но и на более доступных синхротронного beamlines. Здесь мы приводим подробные визуальные протоколы для подготовки, определения характеристик и доставки микрокристаллов в LCP для серийных экспериментов кристаллографии.Эти протоколы включают в себя методы проведения экспериментов кристаллизации в шприцах, обнаружения и характеризующие образцы кристаллов, оптимизируя плотность кристалла, погрузка микрокристаллов груженого LCP в инъекционного устройства и доставки образца к пучку для сбора данных.

Introduction

Рентгеновская кристаллография является самым успешным на сегодняшний день метод для решения структур с атомным разрешением мембранных белков (MPS). Кристаллизация из липидных мезофазы, также известный как липидный кубической фазы (LCP), или в мезо кристаллизации, представляет собой одно из главных событий в MP кристаллографии , что позволило определить структуру высокого разрешения непростых целей , таких как G-белком рецепторов (GPCRs ) 1. Последние достижения в области LCP инструментов и технологий сделали эту технику доступной для большого сообщества структурных биологов по всему миру 2. Тем не менее, во многих случаях кристаллы МП , которые формируются в LCP слишком малы , чтобы использовать даже на самых передовых микрофокусный синхротронного beamlines, где образцы страдают от сильной радиационного повреждения и ухудшения качества, прежде чем достаточный сигнал с высоким разрешением может быть получено 3.

Предложен новый подход к кристаллографической сбора данныхбыл включен с вводом в эксплуатацию первого рентгеновского лазера на свободных электронах (XFEL). Метод основан на принципе "дифракции перед разрушением», впервые представленная теоретически 4 , а затем экспериментально подтверждена на биологических образцах при ЛУ когерентного источника света (LCLS) 3, в мире пионером в области жестких XFELs. XFEL генерирует высокой яркости рентгеновских импульсов в течение нескольких десятков фемтосекундной длительности, что дифракция от нетронутых кристалла до того, как атомы белка могут двигаться в ответ на радиационное повреждение. В первых экспериментах, микрокристаллы непрерывно подавали на пересечении с XFEL пучком в водном потоке , полученного с помощью жидкостного инжектора 5. Эта экспериментальная установка известна как последовательный фемтосекундного кристаллографии (SFX). Основной недостаток использования жидких форсунок для SFX является их высокая скорость потока, что в свою очередь требует от десятков до сотен миллиграммов очищенного белка для сбора полного набора данных. По эмиloying специальный инжектор , который может обрабатывать гелеобразных образцы LCP (LCP microextrusion инжектор) 6, мы успешно доставленных микрокристаллы нескольких различных человеческих GPCRs , выращенных в матрице ЖКП и получили их структуры с высокой разрешающей способностью 6 – 9, со значительно уменьшенным белка расход до менее 0,3 мг в наборе данных. Форсунка состоит из резервуара, который может содержать до 20, 40 или 100 мкл кристаллического нагруженные LCP и узкий капилляр (10-50 мкм в диаметре), через которую образец экструдированных с применением высокого давления (до 10000 фунтов на квадратный дюйм) с гидравлическим плунжером со стадией давления усиливается, движимый жидкости из ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) с насосом. Поток, выходящий из LCP капиллярного сопла стабилизируется параллельным потоком омическим газа (как правило, гелий или азот).

Здесь мы предлагаем визуальные демонстрации шагов, необходимых для подготовки и образцы характеризуютдля эксперимента LCP-SFX. Дополнительные сведения можно найти в опубликованных протоколах 10. В качестве примера, мы будем использовать аденозина А 2A рецептор 11 и подготовить кристаллов этого белка в LCP для сбора данных рентгеноструктурного с использованием SFX подхода. В то время как наши протоколы совместимы с любой инжектор, способный потокового LCP для сбора данных по серийному кристаллографии в XFEL и синхротронного источников, в целях иллюстрации, мы будем использовать LCP инжектор, описанной в работе. 6. Оптимизированные условия осадителя , которые производят микрокристаллы высокой плотности в ЛКП должны быть идентифицированы с высокой пропускной способностью кристаллизации скрининг 12,13 , прежде чем перейти к этому протоколу. Типичная блок – схема алгоритма для данного протокола показан на рисунке 1.

Protocol

1. Фильтрация Решения и липидами Примечание: Все реактивы и инструменты, используемые в настоящем протоколе должны быть как можно более чистым, чтобы избежать введения загрязняющих частиц в образцах, которые могут засорить LCP инжектор. Фильтр все растворы осадителя и расплавленных липидов через 5 мкм со спином вниз фильтров. Чистые шприцы и нанесите сжатый воздух, чтобы высохнуть. Необязательно использовать портативный чистой комнаты капот для предотвращения захвата частиц пыли или волокон во время процедур подготовки проб. 2. Воссоздание МП в LCP Примечание: выбор лучшего LCP – хозяина липида для кристаллизации зависит от целевого МП, и , как правило , определены в ходе хозяина липидных скрининга кристаллизации испытаний 14. Monoacylglycerols (MAGS) представляют собой наиболее распространенный класс липидов , используемых для LCP кристаллизации 15. Эти протоколы основаны на использовании 9.9 MAG (моноолеин) в качествепровести липида, так как это является наиболее успешным для липидного в мезо кристаллизации на сегодняшний день 16. 9.9 MAG может быть заменена другими липидами LCP-хозяев или липидных смесей после того, как с учетом различий в их фазовом поведении. Например, в случае GPCRs, моноолеин, как правило, легированные холестерина для стабилизации рецептора. При этом используют 9: 1 (вес / вес) 9,9 МАГ: холестерин смеси в качестве принимающей липидов. Mix целевой MP, который очищают в растворе моющего средства мицеллы, с соответствующим липида LCP – хозяина , используя два шприца (# 1 и # 2) и переходник, как было описано ранее 13. Если коротко, то нагрузка шприц # 1 с расплавленным липидного и шприц № 2 с раствором МП. Используйте соотношение между липидными и водным раствором МП , соответствующее уровню , который немного ниже максимальной способности гидратации соответствующего LCP – хозяина липида, например, 3: 2 об / об липид / МП раствор 9,9 MAG, 1: 1 об / об липидный раствор / MP для большинства других коротких MAGS цепи (7.9 MAG, 9,7 МАГ и т.д.). Соединить шприцы через шприц ответвитель и начинают перемешивание вещества, отпустив плунжеры для перемещения смеси туда и обратно между шприцами, пока образец не станет однородной и прозрачной. Приготовьте приблизительно 50 мкл образца LCP для сбора полного набора данных по ЖКП-SFX. Конечный объем образца, как правило, увеличится примерно в два раза (до ~ 100 мкл) после консолидации образца и липидного титрования (раздел 5). 3. Настройка Кристаллизация в шприцах После того, как формируется прозрачная и однородная LCP, переместить весь образец в шприц # 2. Отделить шприц # 1, сохраняя при этом переходник, соединенный с шприцем # 2. Подключите съемную иглу (избыточное давление 26s), чтобы еще 100 мкл чистый шприц (шприц # 3) и аспирата примерно 70 мкл осаждающего раствора в него. Состав осаждающего раствора, который вызывает Formation микрокристаллов высокой плотности является уникальным для каждой цели МП и должны быть определены, прежде чем перейти к этим протоколам. При этом используют композицию оптимизированный осадителя решение , которое дает ливни микрокристаллов рецептора А 2A (40 мМ тиоцианат натрия, 100 мМ цитрат натрия , рН 5, 26-28% ПЭГ 400). Отсоедините иглу от шприца, # 3, удерживая манжету из тефлона внутри шприца. Подключите шприцы # 2 и # 3 через муфту, убедившись, что тефлоновые манжеты установлены правильно в обоих шприцев. Осторожно ввинтите переходник плотно в рабочее положение. Сориентировать спаренные шприцы вертикально с шприц № 2 на дне и инъекционные белка нагруженные LCP образца из шприца # 2 в шприц # 3 медленно и постепенно, пока строка LCP не коснется поршень шприца # 3. Вводимый объем LCP составит около 1/10 от первоначального объема осадителя в шприц # 3 (~ 7 мкл). Проверьте громкость с помощью шкалы чтении на обоих syriНГРЭС (оба плунжеры должны двигаться примерно 7 мкл). Отсоедините шприц # 2. Ответвитель в настоящее время подключен только к шприцевой # 3, который содержит образец, погруженный в осаждающий раствор. Используйте парафином, чтобы полностью закрыть шприц # 3, в том числе интерфейс поршень шприца, открытого торца муфты и иглы гайки. Неполная герметизация на этом этапе может привести к осадителя условий для изменения и образец обезвоживать. Повторите шаги 3.3-3.7 для установки кристаллизации в 6 дополнительных шприцев (# 4- # 9) с использованием в общей сложности ~ 50 мкл образца LCP (~ 7 мкл ЖКП на каждый шприц). Хранить запечатаны шприцы в полиэтиленовом мешке с закрывающийся один или два безволокнистого ткани очищающие предварительно пропитанные водой для защиты от образца обезвоживания. Печать мешок и хранить шприцы в инкубаторе с C 20 ° в процессе роста кристалла. 4. Обнаружение Кристалл Извлеките шприцы из инкубатора к изображению LCP образцы непосредственно внутри шприца (# 3- # 9) каждый 12-24 ч под стереомикроскопа с кросс-поляризованного света. Выявление кристаллов, как плотно упакованных блестящими частицами или, в случае меньшего размера кристалла как однородного свечения из LCP нити. Возвращение запечатанные шприцы в мешок, и хранить при температуре 20 ° С для последующего использования. 5. Пример консолидации и Титрование 7.9 MAG Примечание: Этап липидный титрование описано здесь преследует две цели: а) усваивать избыток раствора осадителя и б) для предотвращения замораживания липидов при инъекции в XFEL пучка. Когда образец ЖКП состоит из 9,9 MAG впрыскивают в вакуумную камеру для сбора данных, интенсивное испарение может охладить образец до температуры ниже равновесной температуры фазового перехода (~ 18 ° C), превращение части образца в пластинчатой ​​кристаллической фазы (Lc). Эти участки Lc фазы, при попадании луча, производят интенсивный порошок diffrкольца действий , которые могут повредить чувствительный детектор 6, такие как детектор матрицы пикселей Cornell-СЛАКе (CSPAD). Титрование 9.9 MAG образца с более короткой цепью липида (9,7 MAG или 7.9 MAG) устраняет эту проблему, так как такие смеси имеют более низкие температуры фазового перехода. Здесь мы опишем титрование LCP, состоящей из 9,9 MAG с 7.9 MAG. При более коротких МАГС цепи (9,7 MAG, 7,9 MAG и т.д.) используются для кристаллизации или когда последовательные данные , кристаллография собираются при давлении окружающей среды титрование на этапе 5.11 по – прежнему требуется, но она может быть выполнена с использованием оригинального ЖКП – хозяина липид , используемый для кристаллизация. Около 1 час до начала сбора данных, удалите шприцы с образцами из 20 ° C инкубатора. Выберите 2-4 шприцы для консолидации образца на основе аналогичного внешнего кристалла и подобия условий кристаллизации. Осторожно удалите парафином уплотнительный из выбранных шприцев. Удалитьшприц переходник и приложите чистый съемной иглой (манометрическое 26s) до первого выбранного шприца. Осторожно и медленно толкать поршень вперед, чтобы сжать осадителя через иглу в микроцентрифужных трубки. Соблюдать осторожность на этом этапе, так как приложения высокого давления на плунжер на этом этапе может извлечь некоторые из кристалла нагруженные LCP вместе с осадителя раствором, что приводит к частичной или полной потере образца. Прекратить плунжер, когда большая часть осадителя была удалена и ЖКП накопила при входе иглы. Повторите шаг 5.4-5.5 с другими выбранными шприцы. Чтобы закрепить полученные в результате образцы LCP, соединить два шприца вместе через чистую ответвителя. Нажмите на поршень шприца на одном, чтобы передать весь образец от одного из шприцев в другой. Отсоедините пустой шприц. Повторите шаги 5.7-5.9 для консолидации всех кристаллов груженого ЖКП материала от двух до четырех опережающих-selected шприцы в один шприц. Удалить столько осадитель, насколько это возможно. Добавить ~ 5 мкл 7,9 MAG или оригинальной короткой цепью MAG-хозяина липида в пустой шприц. Подключите этот шприц в шприц с обобщенным образца с помощью шприца ответвителя и перемешать с помощью шприца в качестве альтернативы удручает плунжеров. Повторяйте, пока весь остаточный раствор не поглощается и однородным и прозрачным LCP формируется. Окончательное количество ЖКП после титрования может варьироваться от 20 до 35 мкл в зависимости от объема избытка осадителя и его состав. Переместить весь смешанный образец LCP в один шприц и отсоедините пустой шприц. 6. Характеристика микрокристаллов Приложите нагрузки иглы LCP-инжектор (точка стиль 3, калибр 22, один дюйм в длину) к шприцу с консолидированной образца. Осторожно извлечь ~ 1 мкл образца ЖКП на предметное стекло и накройте ее покровным стеклом. Аккуратно нажмите наКрышка скольжения для сэндвича образца. Возьмите изображения образца ЖКП под стереомикроскопа на самом высоком возможном увеличении (обычно 100X) с использованием светлого поля освещения и кросс-поляризаторов. Если это возможно, принять дополнительные изображения с использованием УФ-флуоресцентного микроскопа и SONICC (второго порядка нелинейного формирования изображения хиральных кристаллов) 17 Imager , чтобы подтвердить наличие белка микрокристаллов в образце. Расчетный размер кристаллов и плотность 10. Идеальная плотность кристалла для эксперимента сбора данных будет зависеть от размера кристаллов, диаметр пучка рентгеновского излучения и диаметра потока LCP, и должно привести к скорости попадания кристаллов примерно на 10-40%. 7. Регулировка плотности Кристал Примечание: Если плотность кристалла найденных на шаге 6.4 слишком высока, что приводит к большой процент многократных попаданий кристаллов, кристаллы должны быть разведены следующие шаги, описанные ниже, чтобы оптимизироватьобразец для сбора данных. Если плотность кристалла является слишком низкой для эффективного сбора данных во всех подготовленных образцах, то условия роста кристаллов должны быть повторно оптимизированы, так как не существует надежного способа концентрирования кристаллов МП в LCP. Подготовьте необходимое количество аккуратной LCP будет использоваться для разбавления, имитируя композицию (LCP же, липидный и осадитель) исходного образца с кристаллами, которые необходимо разбавить. Переместить все аккуратные LCP в один шприц. Отделить пустой шприц, но оставьте переходник, соединенный. Извлеките иглу из шприца, содержащего образец LCP с микрокристаллов. Подключите образец шприца в шприц, содержащий аккуратные LCP через переходник. Смешайте содержимое шприцов, толкая его назад и вперед через ответвитель, пока гомогенность не будет достигнута. Повторите Раздел 6 для повторной оценки плотности микрокристаллов в скорректированной образце. 8. LCP Инжектор Загрузкай LCP-SFX сбора данных Отсоедините переходник от шприца с образцом и прикрепить 1 "загрузку иглу шприца. Передача 20-40 мкл образца в резервуар с LCP инжектора. Вставьте LCP инжектора в камеру 18 образца, запустите инжектор, регулировать скорость потока и сбора данных LCP-SFX. 9. Включение растворимого белка Кристаллы в LCP Примечание: Использование высоковязких сред, таких как LCP, для доставки кристаллов растворимых белков позволяет значительно уменьшить потребление белка в последовательном кристаллографии эксперимента. В этих шагах, которые мы описали, как включить кристаллы растворимых белков LCP. Кристаллы могут быть получены любым методом, объединены вместе в виде суспензии кристаллов и фильтруют, если это необходимо. Отрегулируйте плотность кристалла в виде суспензии, чтобы обеспечить кристально хит ставки примерно 10-40%. TТекущая совместимость осадителя раствора с использованием LCP 7.9 MAG, 9.7 MAG или смесь 1: 1 7,9 MAG и 9,9 MAG в качестве принимающей липида. Смешайте ~ 25 мкл суспензии кристаллов с ~ 25 мкл хозяина липида не с помощью шприца смеситель до получения однородной LCP форм. Оценить размер кристаллов и плотность, как описано в разделе 6. Загрузите образец в ЖКП инжектора и сбора данных, как описано в разделе 8.

Representative Results

Ниже мы опишем репрезентативные результаты , полученные с помощью образцов , полученных с помощью вышеперечисленных протоколов, что позволило нам собрать данные SFX и решать структуры с высокой разрешающей способностью пяти человеческих GPCRs: серотониновых рецепторов 5-HT 2B в комплексе с агонистом эрготамина 8 (PDB ID 4NC3 ), сглажена рецептор (СМО) в комплексе с антагонистом cyclopamine 6 (PDB ID 4O9R), δ-опиоидных рецепторов в комплексе с бифункциональным пептидный лиганд ОРДП-NH 2 7 (PDB ID 4RWD), ангиотензин – рецептора в комплексе с блокатор ZD7155 9 (PDB ID 4YAY), и комплекс между родопсина и arrestin 19 (PDB ID 4ZWJ); и два теста растворимые белки: лизоцим (PDB ID 4ZIX) и фикоцианина (PDB ID 4ZIZ). 5-HT 2B опосредует различные центральные и периферийные функции , физиологические нейромедиатора серотонина. Этот рецепторбыла использована для создания и проверки метода LCP-SFX, путем сравнения структуры при комнатной температуре, полученной при LCLS с cryocooled структурой решена традиционным microcrystallography на Advanced Photon Source (APS). В общей сложности ~ 100 мкл образца LCP с белком микрокристаллов (средний размер примерно 5 мкм) был получен и использован для сбора данных SFX, и структура ЖКП-SFX из 5НТ 2B была успешно решена на уровне 2,8 А (рисунок 2) 8. Дополнительные полезные сведения о подготовке проб и сбора данных представлены в таблице 1. Сглаживается рецептора (SMO) является членом класса F GPCRs и молекулярная мишень из Teratogen cyclopamine, с хорошо демонстрируемых функций в эмбриональном развитии и росте опухоли. Первоначально, относительно крупные кристаллы SMO / cyclopamine со средним размером 120 × 10 × 5 мкм были получены, а затем использовали для collecti данныхна в качестве источника синхротронного с использованием обычного гониометра на основе кристаллографии. Тем не менее, эти большие кристаллы получают плохую дифракцию на микро-фокус пучкового (10 мкм в диаметре) страдает от большого мозаичности (выше 2-3 градусов), вероятно, связано с накоплением дефектов роста кристаллов, или от эффектов, связанных с cryocooling. ЖКП-SFX, тем не менее, позволило нам собрать качество дифракционных данных, полученных при LCLS от микронных кристаллов 5 при комнатной температуре. Структура была решена методом молекулярного замещения при анизотропной 3.4, 3.2 и разрешением 4,0 Å вдоль трех главных осей, четко определив расположение cyclopamine в связывающем кармане 6 (рисунок 3). Алкалоид опиаты, такие как морфин, Ориентирование мю-опиоидных рецепторов (μ-ОР) широко используются для тяжелой боли. Тем не менее, их использование приводит обширные к приобретенной толерантности и зависимости. Совместное введение морфиновс δ-опиоидных рецепторов (δ-OR) антагонистов было показано, чтобы предотвратить вышеназванные побочные эффекты, тем самым способствуя поиск соединений со смешанным б-ИЛИ-антагонистической и М-OR-агониста функции. Нами были получены исходные данные дифракции на δ-ИЛИ в комплексе с бифункциональным тетра-пептид ОРДП-NH 2 с использованием cryocooled кристаллы , которые дифрагированного до 3,3 Å при синхротронного рентгеновского источника с использованием традиционных гониометра на основе стратегии сбора данных. Эти данные показали, частично неоднозначное электронной плотности для пептида лиганда. Впоследствии XFEL дифракционные данные при комнатной температуре были получены и структура была определена на уровне 2,7 разрешением показ четкую плотность дл лиганда и рецептора 7. Эта структура дала возможность для дальнейшего понимания опиоидной функции рецептора и селективности и при условии ценную информацию для разработки новых анальгетиков. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-paGE = "1"> ангиотензин II рецептора типа 1 (AT 1 R) представляет собой GPCR , выступающей в качестве основного регулятора кровяного давления. Мы кристаллизуется AT 1 R в комплексе с антагонистом ZD7155 в LCP. Оптимизированные кристаллы достигли максимального размера 40 × 4 × 4 мкм 3 с лучшей дифракции достигает лишь ~ 4 Å на источнике синхротронного. Путем изменения условий кристаллизации, мы получили ливни мелких кристаллов (10 × 2 × 2 мкм 3), которые были использованы для получения структуры температуры в помещении в 2,9 А , используя разрешение XFEL излучения. В общей сложности 2,764,739 изображений детектора были собраны , чтобы сделать полный набор данных от примерно 65 мкл кристаллического нагруженные LCP соответствует примерно 0,29 мг белка 9. Из общего количества кадров, 457275 были идентифицированы как кристаллические хиты, что соответствует хит ставке 17%, из которых 73,130 кадров (16% обращений) были успешно проиндексированы и интегрированной. гДЗП сигнал через два основных пути, опосредованных либо G белками или arrestins. Структура адренергического рецептора β 2 , прикрепленных к гетеротримерный л о р а белка была решена несколько лет назад 20, в то время как структура GPCR в комплексе с arrestin оставался неуловимым. Мы получили небольшие кристаллы гибридного белка родопсина-arrestin в LCP, которая достигла 25-30 мкм в длинном измерении, но, несмотря на обширные оптимизации, дифрагирует только ~ 7 резолюции А на источниках синхротронного. При использовании метода LCP-SFX, в течение 12 часов XFEL beamtime, мы собрали 22,262 кристалл хитов, из которых 18,874 образцы были успешно проиндексированы и интегрированы в анизотропную пределы разрешением 3,8 Å / 3.8 / 3.3 19. Родопсин-arrestin является очень сложным белковым комплексом, противоставших определения структуры с использованием традиционных подходов. Успешное определение этой структуры продемонстрировала огромный потенциалметод LCP-SFX для решения сложных проблем и предоставил уникальную возможность изучить механизм arrestin-предвзятым сигнализации в GPCRs. Наконец, в дополнение к мембранным белковых кристаллов, выращенных в липидной фазе, наша подготовка проб и способ доставки был успешно адаптирован для растворимых белковых кристаллах, где ЖКП используется в качестве несущей среды для доставки кристаллов, что позволило значительно уменьшить потребление белка требуется для определения структуры. Структуры двух модельных белков, лизоцим и фикоцианина, были решены при 1,89 Å и 1,75 Å соответственно разрешение этим методом, с использованием менее чем 0,1 мг каждого белка 21. Серотонин рецептора 2B сглаживается рецептора <strong> Δ-опиоидных рецепторов Ангиотензин II рецептора типа 1 Родопсин-Arrestin Лизоцим Фикоцианин PDB ID 4NC3 4O9R 4RWD 4YAY 4ZWJ 4ZIX 4ZIZ Общая выборка используется *, мкл 100 83 50 65 75 10 10 Общий белок используется, мкг 300 500 300 290 340 100 100 Средний размер кристаллов, мкм 5 × 5 × 5 <5 5 × 2 × 2 10 × 2 × 2 5-10 5 × 2 × 2 10 × 10 × 5 Хит ставка,% 3.6 7.8 5.9 17 0,45 40 6.5 Общее время сбора данных, ч 10 8 4.6 6.4 12 0,75 0,67 Количество индексированных моделей 32819 61964 36083 73130 18874 54544 6629 Пространственная группа С 2 2 2 1 P 2 1 C 2 C 2 Р 2 1 2 1 2 1 P 4 3 2 1 2 H 3 2 Разрешение, Å 2.8 3.2 / 3.4 / 4.0 2.7 2.9 3,3 / 3,8 / 3,8 1,89 1,75 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-paGE = "1"> * После того, как липидный титрование Таблица 1. Резюме статистики подготовки проб и сбора данных для представительных структур решается методом LCP-SFX. Количество образца, необходимый для эксперимента ЖКП-SFX зависит от кристаллической дифракционной качества, плотности кристалла, диаметр сопла форсунки, а также от частоты следования размера XFEL луча, интенсивность и импульса. Рисунок 1. Схема типичной процедуры подготовки образца для подготовки проб LCP-SFX. Начинается с LCP кристаллизации белка – мишени в газонепроницаемых стеклянных шприцах. После того, как получены кристаллы, кристалл-нагруженные LCP консолидируется в одном шприце и титруют с дополнительным липида, к absorб избытка раствора осадителя. Кристаллы затем охарактеризованы с использованием различных методов микроскопии до сбора данных XFEL. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2. Репрезентативный результат, структура 5-НТ 2B в комплексе с эрготамин. (а) микрокристаллы 5-HT 2B / эрготамина визуализируют с помощью режима микроскопа светлого поля 8. Эта цифра была повторно из работы 8 с разрешения авторского права от науки. (Б) микрокристаллов 5-HT 2B / эрготамина визуализируют с помощью режима 8 кросс-поляризационный микроскоп. Эта цифра была повторно из ссылки 8 с авторскими правамиразрешение от науки. (с) представление мультипликационную 2B структуры 5-HT / эрготамин , полученного подходом ЖКП-SFX. Липиды, которые были построены в модели показаны в представлении палочке. В качестве лиганда используют эрготамин показан в представлении сферах. Сплошные линии показывают приблизительные границы мембраны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3. репрезентативный результат, структура SMO в комплексе с cyclopamine. Левая панель, микрокристаллы SMO / cyclopamine визуализируют с помощью режима кросс-поляризационный микроскоп 6. Эта цифра была повторно исследование 6 с разрешения авторского права от Nature Communications. Правая панель, мультфильм representatiна структуры SMO / cyclopamine полученного подходом LCP-SFX. Лиганд cyclopamine показано в представлении сферах. Сплошные линии показывают приблизительные границы мембраны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Описанные здесь протоколы обеспечивают общую схему процедуры подготовки образца для стандартного LCP-SFX эксперимента с LCP инжектора. Основываясь на нашем опыте, общая сумма окончательного микрокристаллов нагруженные образца ЖКП , необходимого для сбора полного набора данных , как правило , 50-100 мкл (Таблица 1; 25-50 мкл исходного белка нагруженные образца LCP), в зависимости от размера микрокристаллов , качество и плотность. Поскольку каждый 100 мкл газонепроницаемые стеклянный шприц может вместить около 7 мкл LCP в виде полностью выдвинутого строки для обеспечения правильной и даже диффузии осадителя раствора в LCP, по крайней мере, от четырех до семи образцов в шприцы должны быть готовы к каждый LCP-SFX эксперимент.

Так как образец выдавливается через узкий 20-50 мкм в диаметре капилляра, крайне важно, чтобы избежать каких-либо инородных материалов в виде частиц в образце. Пыли и волокна, которые могут быть время от времени, введенные в LCPобразец или осадителя растворы могут засорить форсунки капилляр и увеличить время простоя во время эксперимента. Поэтому, важно, чтобы фильтровать липидный и все решения через поры фильтра 5 мкм перед приготовлением образцов. По желанию, чистая комната или портативный чистый капот номер может быть использован для приготовления образца.

Эти протоколы основаны на использовании 9.9 MAG (моноолеин) в качестве принимающей липидов для МП кристаллизации. Они, однако, не ограничиваются 9,9 МАГ и может быть легко адаптирована к любым другим липидов ЖКП-хозяев или смеси липидов, после того, как с учетом различий в липидной фазе поведения. Большинство структур депутатов кристаллизовались в LCP были получены с использованием одного из МАГС, с 9,9 МАГ является наиболее успешным представителем до сих пор 15. Основной недостаток использования 9.9 MAG для SFX является его переход к пластинчатой ​​кристаллической фазы при охлаждении ниже 18 ° С, что часто происходит, когда сбор данных осуществляется в вакууме. titratiна 7,9 MAG описано в разделе 5 настоящего протокола обеспечивает хорошее решение этой проблемы. По нашему опыту, кристаллы выдерживают такое титрование без каких-либо побочных эффектов. Если, тем не менее, добавление 7,9 MAG или другой короткой цепью MAG не желательно титрование может быть выполнена с 9,9 MAG. В этом случае газ, который стабилизирует течение ЖКП при его инжекции в вакуум должен быть переключен из гелия в атмосфере азота, который может предотвратить образование кристаллического липидной фазы в большинстве образцов, за счет наличия менее стабильный поток пробы.

Гелеобразную консистенцию ЖКП имеет большое преимущество для использования в качестве носителя кристалл-носителя, так как он позволяет регулировать скорость потока кристалла в широком диапазоне, для сбора данных последовательного кристаллографии современных XFEL и синхротронного источников. Соответствие скорости потока кристалла с результатами частотой повторения импульсов XFEL в резкое сокращение потребления кристаллов на несколько порядков величины Compared для впрыска жидкости. ЖКП является подходящим среда – носитель для доставки не только кристаллов МП , выращенных в ней, но также и для кристаллов растворимых белков 21. Несколько альтернативных вязких сред кристалл носителей недавно были введены 22 – 24, расширяя арсенал инструментов и реактивов для проведения серийных экспериментов кристаллографии. Кроме того, серийный кристаллографии с LCP в качестве доставки кристаллической среды была продемонстрирована на традиционных источниках синхротронного, по крайней мере, хорошо дифракционных кристаллов 24,25. Последующие обновления источников синхротронного, которые повышают рентгеновскую интенсивность на несколько порядков, а также улучшения в технологии детектора, сделает серийный кристаллография еще более доступным и привлекательным методом для определения структуры.

LCP-SFX продемонстрировала свою эффективность для структурного определения МП. Для сложных биологических систем (таких как GPCRs или макромолекулярных комплексов) где лАРГЕ, кристаллы дифракционного качества трудно расти, LCP-SFX может обеспечить привлекательным, если не единственным, жизнеспособным вариантом для решения атомной структуры разрешения. Со всеми его преимуществами, то есть, используя LCP в качестве матрицы для МП кристаллизации и доставки кристалла, низкое потребление белка, отсутствие радиационного повреждения, сбор данных комнатной температуры, возможности изучения временной 26,27 и без требования кристалл уборки, LCP- SFX должны играть важную роль в будущем структурной биологии.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья гранты R01 GM108635 и U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Collaborative семян премии Грант и НФС STC награду 1231306. Мы благодарим А. Уокер за помощь в подготовке рукописи.

Materials

LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) Nu Chek Prep M239 Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) Sigma M7765  Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) Nu Chek Prep M219 Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid 7.9 MAG Avanti Polar Lipids 850534 Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection
Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/mL Target protein
Chloroform Fisher Scientific C606-1 Used to dissolve lipids
Methanol Sigma-Aldrich 179337-500ML Used to wash syringes
Eleven 100 mL Hamilton gas-tight syringes without needles Hamilton 7656-01 For LCP preparation
Eight syringe couplers Hamilton SKU 209526 For LCP preparation
Removable flat-tipped needle Hamilton 7804-01 For LCP dispensing
Parafilm Parafilm M', 250' x 2" Used for syringe sealing
Lint free lens cleaning tissues Fisher NC9592151
Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 mL, Durapore 5 µm Millipore UFC3 0SV 00 Used for filtering of precipitant solutions and lipids
Microscope slides, 1 inch x 3 inch  GoldSeal 3010
Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol VWR 89094-640 These are used to clean the syringes, needles and coupler.  Methanol is used first, then water.
Gloves Microflex XC-310-L For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers
Safety glasses
Pressurized air cans Office Depot (Dust-Off) 527494 For syringe cleaning
Dry block heater with a digital temperature controller Fisher 11-720-10BQ  Used for thawing lipids
Benchtop Centrifuge  Fisher 05-413-340 Spinning down solutions
Clean Room Mini – 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter Sentry Air Systems, Inc. SS-112-PCR Cleaning sample preparation
Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer  Nikon SMZ1500 Crystal density check
UV microscope JAN Scientific UVEX-P Optional, for crystal imaging purposes
SHG imager  Formulatrix SONICC Optional, for crystal imaging purposes
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
  2. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
  3. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  4. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  5. DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505 (2008).
  6. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat Commun. 5, 3309 (2014).
  7. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).
  8. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  9. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  10. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  11. Liu, W., et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science. 337 (6091), 232-236 (2012).
  12. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
  13. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J Vis Exp. (49), (2011).
  14. Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase. Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).
  15. Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, (2009).
  16. Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. Monoolein: a magic lipid?. Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).
  17. Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).
  18. James, D. . Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , 1-126 (2015).
  19. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  20. Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
  21. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).
  22. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).
  23. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
  24. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
  25. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2, 168-176 (2015).
  26. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  27. Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. 513, 261-265 (2014).

Tags

Protein MicrocrystalsLipidic Cubic PhaseSerial Femtosecond CrystallographyMembrane Protein StructureProtein ReconstitutionSample PreparationSyringe HandlingPrecipitant SolutionProtein-laden LCPTeflon SpherulesSample Sealing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J. Vis. Exp. (115), e54463, doi:10.3791/54463 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image