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Biochemistry

Preparación y entrega de microcristales de proteínas en fase cúbica lipídico para la serie de femtosegundo Cristalografía

Published: September 20, 2016
doi:
10.3791/54463
, ,
1The Bridge Institute,University of Southern California, 2Department of Chemistry,University of Southern California, 3School of Molecular Sciences, Center for Applied Structural Discovery at the Biodesign Institute,Arizona State University

Summary

We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.

Abstract

Las proteínas de membrana (MPs) son componentes esenciales de las membranas celulares y dianas farmacológicas primarias. diseño racional de fármacos se basa en la información estructural precisa, por lo general obtenido mediante cristalografía; Sin embargo parlamentarios son difíciles de cristalizar. Los recientes progresos en la determinación estructural MP ha beneficiado en gran medida del desarrollo de métodos lipídicas fase cúbica (LCP) de cristalización, que normalmente producen bien de difracción, pero a menudo cristales pequeños que sufren de daño por radiación durante la recogida de datos cristalográfica tradicional en las fuentes de sincrotrón. El desarrollo de láser de electrones libres nueva generación de rayos X (XFEL) las fuentes que producen pulsos de femtosegundos extremadamente brillantes ha permitido sala de recogida de datos de temperatura de microcristales con nula o insignificante daño por radiación. Nuestros esfuerzos recientes en la tecnología de la combinación de LCP con la cristalografía de femtosegundo en serie (LCP-SFX) han dado lugar a estructuras de alta resolución de varios receptores acoplados a proteínas G humanos, which representar un objetivo muy difíciles para la determinación estructural. En la técnica de LCP-SFX, LCP es reclutado como una matriz para el crecimiento y la entrega de microcristales MP a la intersección de la corriente de inyector con un haz de XFEL para la recopilación de datos cristalográfica. Se ha demostrado que LCP-SFX puede mejorar sustancialmente la resolución de difracción cuando sólo sub-10 micras cristales están disponibles, o cuando el uso de cristales más pequeños a temperatura ambiente puede superar los diversos problemas asociados con cristales cryocooled más grandes, tales como la acumulación de defectos, mosaicidad alta y artefactos crioenfriamiento. futuros avances en las fuentes de rayos X y tecnología de detectores deben hacer la cristalografía de serie muy atractiva y viable para la aplicación no sólo en XFELs, sino también en líneas de luz de sincrotrón más accesibles. Aquí presentamos los protocolos visuales detalladas para la preparación, caracterización y entrega de microcristales en el LCP para los experimentos de cristalografía de serie.Estos protocolos incluyen métodos para realizar experimentos de cristalización en jeringas, detección y caracterización de las muestras de cristal, la optimización de densidad cristalina, cargando microcristales LCP cargado en el dispositivo inyector y la entrega de la muestra a la viga para la recogida de datos.

Introduction

La cristalografía de rayos X es la técnica más exitosa hasta la fecha para resolver estructuras de resolución atómica de las proteínas de membrana (MP). La cristalización en mesofases lipídicos, también conocidas como fase cúbica lipídica (LCP), o en la cristalización meso, representa una de las principales novedades en la cristalografía MP que ha permitido la determinación de la estructura de alta resolución de objetivos desafiantes, tales como los receptores acoplados a proteínas G (GPCR ) 1. Los recientes avances en las herramientas y tecnologías LCP han hecho de esta técnica a disposición de una gran comunidad de biólogos estructurales de todo el mundo 2. Sin embargo, en muchos casos los cristales de MP que se forman en LCP son demasiado pequeños para ser utilizado incluso a más avanzada líneas de luz de sincrotrón microfoco, donde las muestras sufren de grave daño de la radiación y el deterioro antes de señal suficiente en alta resolución se puede obtener 3.

Un nuevo enfoque para la recopilación de datos cristalográficafue habilitado con la puesta en marcha del láser de electrones libres primero de rayos X (XFEL). El método se basa en el principio de "difracción antes de la destrucción", introducido por primera vez en teoría, 4 y luego confirmado experimentalmente en muestras biológicas en el acelerador lineal fuente de luz coherente (LCLS) 3, pionero en el mundo en XFELs duros. Un XFEL genera alto brillo pulsos de rayos X dentro de pocas decenas de duración de femtosegundo que difractan de un cristal de prístina antes de que los átomos de la proteína se pueden mover en respuesta al daño por radiación. En los experimentos iniciales, microcristales fueron suministrados de forma continua a la intersección con el haz de XFEL en una corriente acuosa producido por un inyector de líquido 5. Esta configuración experimental se conoce como la cristalografía de femtosegundo en serie (SFX). El principal inconveniente de utilizar inyectores de líquidos para SFX es su alta velocidad de flujo, que por lo tanto requiere de decenas a cientos de miligramos de proteína purificada para la recogida de un conjunto completo de datos. por employing un inyector especial que puede manejar las muestras LCP de tipo gel (LCP microextrusión inyector) 6, hemos entregado con éxito microcristales de varios diferentes GPCR humanas cultivadas en una matriz LCP y obtuvo sus estructuras de alta resolución 6 – 9, con una proteína reducida significativamente consumo bajo de 0,3 mg por conjunto de datos. El inyector consiste en un depósito que puede contener hasta 20, 40 ó 100 l de LCP cristal cargado y un capilar estrecho (10-50 micras de diámetro) a través del cual la muestra se extruye mediante la aplicación de una alta presión (hasta 10.000 psi) de un émbolo hidráulico con una etapa de amplificación de presión, accionado por un líquido de una bomba de HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento). La corriente de LCP sale de la boquilla capilar se estabiliza mediante un flujo paralelo de gas no reactivo (normalmente helio o nitrógeno).

Aquí nos proporcionan demostraciones visuales de los pasos necesarios para preparar y caracterizar muestraspara un experimento LCP-SFX. Detalles adicionales se pueden encontrar en los protocolos publicados 10. A modo de ejemplo, vamos a utilizar receptor de adenosina A 2A 11 y preparar cristales de esta proteína en el LCP para la recogida de datos de rayos X utilizando el enfoque SFX. Mientras que nuestros protocolos son compatibles con cualquier inyector capaz de streaming de LCP para la recopilación de datos mediante cristalografía de serie en las fuentes de sincrotrón XFEL y, para fines de ilustración, vamos a utilizar el inyector LCP se describe en Ref. 6. condiciones precipitantes optimizados que producen microcristales de alta densidad en LCP deben ser identificados mediante la cristalización de alto rendimiento de cribado de 12,13 antes de proceder a este protocolo. Un diagrama de flujo típico para este protocolo se muestra en la Figura 1.

Protocol

1. Las soluciones de filtrado y Lípidos Nota: Todos los reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo debe ser lo más limpia posible para evitar la introducción de partículas contaminantes en las muestras, que pueden obstruir el inyector LCP. Filtrar todas las soluciones precipitantes y lípidos fundido a través de filtros spin-down 5 micras. jeringas limpias a fondo y se aplican aire comprimido para secar. Opcionalmente, usar una capucha de sala limpia portátil para evitar atrapar partículas de polvo o fibras durante los procedimientos de preparación de muestras. 2. La reconstitución de MP en el LCP Nota: La elección de la mejor lípidos anfitrión LCP para la cristalización depende del destino MP, y por lo general se identifica durante los ensayos de cribado de cristalización de lípidos de acogida 14. Monoacilgliceroles (MAGs) representan la clase más común de los lípidos utilizados para la cristalización LCP 15. Los protocolos se basan en el uso de 9,9 MAG (monooleına) como elsede de lípidos, ya que este es el más exitoso de los lípidos en el meso cristalización hasta la fecha 16. 9.9 MAG puede ser sustituido por otros lípidos de acogida LCP o mezclas de lípidos después de tener en cuenta las diferencias en su comportamiento de fase. Por ejemplo, en el caso de los GPCRs, monooleína típicamente se dopa con el colesterol para la estabilización receptor. Aquí, utilizar 9: 1 (w / w) 9,9 MAG: mezcla de colesterol como lípido host. Mix objetivo MP, que se purifica en una solución de detergente de micelas, con el lípido anfitrión LCP apropiado utilizando dos jeringas (# 1 y # 2) y un acoplador, como se describió anteriormente 13. En pocas palabras, la carga de la jeringa # 1 con el lípido fundido y la jeringa # 2 con la solución MP. Utilice una relación entre los lípidos y la solución MP acuosa correspondiente al nivel que es justo por debajo de la capacidad de hidratación máxima de la correspondiente lípidos anfitrión LCP, por ejemplo, 3: / v de lípidos solución / MP para 9,9 MAG, 2 v 1: v / 1 v solución / MP de lípidos para la mayoría de otros MAG de cadena más corta (7,9 MAG, 9,7 MAG, etc.). Conectar las jeringas a través de un acoplador de jeringa y empezar a mezclar las sustancias presionando los émbolos para mover la mezcla hacia atrás y adelante entre las jeringas, hasta que la muestra se vuelve homogénea y transparente. Preparar aproximadamente 50 l de la muestra LCP para la recogida de un conjunto completo de datos de LCP-SFX. El volumen final de la muestra por lo general se incrementará en aproximadamente un factor de dos (a ~ 100 l) después de la consolidación de la muestra y la valoración de los lípidos (Sección 5). 3. Configuración de la cristalización en jeringas Después se forma un LCP transparente y homogénea, mover toda la muestra en la jeringa # 2. Separar jeringa # 1, mientras se mantiene el acoplador conectado a la jeringa # 2. Conectar una aguja extraíble (26s calibre) para otros 100 l jeringa limpia (jeringa # 3) y aspirado aproximadamente 70 l de la solución precipitante en ella. La composición de la solución precipitante que desencadena formación de microcristales de alta densidad es único para cada objetivo MP y debe ser determinado antes de continuar con estos protocolos. Aquí, utilizar una composición de la solución precipitante optimizado que produce una lluvia de microcristales del receptor A2A (tiocianato de sodio 40 mM, 100 mM de citrato de sodio pH 5, 26 a 28% PEG400). Desconectar la aguja de la jeringa # 3 mientras se mantiene el casquillo de teflón dentro de la jeringa. Conectar jeringas # 2 y # 3 a través del acoplador, asegurándose de que los casquillos de teflón estén en su sitio en ambas jeringas. Enroscar cuidadosamente el acoplador firmemente en su posición. Orientar las jeringas acopladas verticalmente con jeringa # 2 en la parte inferior e inyectar la muestra LCP proteína cargada de jeringa # 2 # 3 en la jeringa lentamente y de manera constante hasta que la cuerda LCP toca el émbolo de la jeringa # 3. El volumen inyectado LCP ascenderá a aproximadamente 1/10 del volumen inicial de precipitación en la jeringa # 3 (~ 7 l). Verificar el volumen de la escala de lectura en ambos syringes (ambos émbolos deben moverse alrededor de un 7 l). Desconectar la jeringa # 2. El acoplador ahora solamente está conectada a la jeringa # 3 que contiene la muestra sumergida en la solución precipitante. Use Parafilm para sellar completamente la jeringa # 3, incluyendo la interfaz de émbolo de jeringa, el extremo de apertura del acoplador y la tuerca de la aguja. Cierre incompleto durante este paso puede hacer que las condiciones precipitantes para cambiar la muestra y para deshidratar. Repita los pasos 3.3-3.7 para establecer la cristalización en 6 jeringas adicionales (# 4- # 9) que utiliza un total de ~ 50 l de la muestra LCP (~ 7 l de LCP por cada jeringa). Almacenar sellada jeringas en una bolsa de plástico con cierre con uno o dos tejidos de limpieza libres de fibra pre-empapados con agua para proteger contra la deshidratación de la muestra. Sellar las jeringas bolsa y almacenar en una incubadora a 20 ° durante el crecimiento de los cristales. 4. Detección Crystal Retire las jeringas de la incubadora a la imagen de LCP muestras directamente dentro de las jeringas (# 3- # 9) cada 12-24 horas bajo un microscopio estereoscópico con luz polarizada cruzada. Identificar los cristales como partículas brillantes apretados o, en el caso del tamaño de cristal más pequeño como un brillo uniforme desde el filamento LCP. Devolver las jeringas sellados a la bolsa, y almacenar a 20 ° C para su uso futuro. 5. Consolidación de la muestra y valoración con 7,9 MAG Nota: El paso de titulación de lípidos aquí descrito sirve para dos propósitos: a) para absorber el exceso de la solución precipitante y b) para prevenir la congelación de lípidos tras la inyección en el haz XFEL. Cuando una muestra de LCP compuesto de 9,9 MAG se inyecta en una cámara de vacío para la recogida de datos, la evaporación intensiva puede enfriar la muestra a temperaturas por debajo de la temperatura de transición de fases en equilibrio (~ 18 ° C), la conversión de las partes de la muestra en una fase cristalina lamelar (Lc). Estos parches de fase Lc, cuando es golpeado por el haz, producen un calor intenso en polvo diffranillos de acción que pueden dañar un detector sensible a 6, como el detector de matriz de píxeles de Cornell-SLAC (CSPAD). La titulación de 9,9 muestra MAG con un lípido de cadena más corta (9,7 MAG o 7,9 MAG) alivia este problema, ya que tales mezclas tienen temperaturas de transición de fase más bajos. A continuación, describimos la titulación de un compuesto de LCP 9.9 MAG MAG con un 7,9. Cuando se utilizan MAGs de cadena más corta (9,7 MAG, 7,9 MAG, etc.) para la cristalización o cuando los datos de cristalografía de serie se recogen a presión ambiente todavía se requiere la titulación en la etapa 5.11, pero se puede realizar utilizando el lípido anfitrión LCP original, empleado para cristalización. Acerca de 1 hr antes del comienzo de la recogida de datos, retirar las jeringas con las muestras de la 20 ° C incubadora. Seleccione 2-4 jeringas para la consolidación de la muestra sobre la base de una apariencia cristalina similar y similitud de las condiciones de cristalización. Retirar con cuidado el Parafilm sellado de las jeringas seleccionados. retirarel acoplador de jeringa y conecte una aguja extraíble limpia (26s calibre) a la primera jeringa seleccionada. Suave y lentamente empujar el émbolo hacia adelante para apretar el precipitante a cabo a través de la aguja en un tubo de microcentrífuga. Tenga cuidado en este paso porque la aplicación de una alta presión sobre el émbolo en este paso podría expulsar algunos de los LCP cargado de cristal junto con la solución precipitante, que conduce a una pérdida parcial o completa de la muestra. Detener el émbolo cuando la mayor parte del precipitante se ha eliminado y el LCP se ha acumulado en la entrada de la aguja. Repita el paso 5.4 a 5.5 con las otras jeringas seleccionados. Para consolidar las muestras resultantes LCP, conectar dos jeringas juntos a través de un acoplador limpia. Presionar el émbolo en una jeringa para transferir toda la muestra de una de las jeringas a otro. Desconectar la jeringa vacía. Repetir los pasos 5.7 a 5.9 para consolidar todo el material de LCP cargado de cristal de dos a cuatro preSelectos jeringas en una jeringa. Eliminar la mayor cantidad posible de precipitación. Añadir ~ 5 l de 7,9 MAG o la cadena más corta de lípidos de acogida MAG original a una jeringa vacía. Conectar esta jeringa a la jeringa con la muestra consolidada a través de un acoplador de jeringa y mezclar presionando alternativamente émbolos de la jeringa. Repetir hasta que toda la solución residual se absorbe y se forma un LCP homogénea y transparente. La cantidad final de LCP después de la valoración puede variar de 20 a 35 l en función del volumen del exceso de precipitante y su composición. Mover toda la muestra LCP mezclado en una jeringa y desconecte la jeringa vacía. 6. Caracterización de microcristales Coloque una aguja de LCP-inyector de carga (tipo de los puntos 3, de calibre 22, una pulgada de largo) a la jeringa con la muestra consolidada. extraiga cuidadosamente ~ 1 l de la muestra de LCP sobre un portaobjetos de vidrio y se cubre con una cubierta de vidrio deslizante. Presione suavemente sobre lahoja de cubierta para intercalar la muestra. Tomar imágenes de la muestra LCP bajo un microscopio estereoscópico con el máximo aumento posible (normalmente 100X), utilizando una iluminación de campo brillante y polarizadores cruzados. Si es posible, tomar imágenes adicionales usando un microscopio de fluorescencia UV y un SONICC (segunda orden no lineal de imágenes de cristales quirales) 17 generador de imágenes para confirmar la existencia de microcristales de proteína en la muestra. Estimar el tamaño del cristal y de la densidad 10. La densidad cristalina ideal para un experimento de recogida de datos dependerá de la tamaño de cristal, el diámetro del haz de rayos X y el diámetro de la corriente de LCP, y debería resultar en una tasa de éxito de cristal de aproximadamente 10 a 40%. 7. Ajuste de cristal Densidad Nota: Si la densidad cristalina encontró en el paso 6.4 es demasiado alto, lo que resulta en un gran porcentaje de golpes múltiples de cristal, los cristales se deben diluir siguiendo los pasos descritos a continuación para optimizar lamuestra para la recolección de datos. Si la densidad del cristal es demasiado baja para la recopilación de datos eficiente en todas las muestras preparadas, a continuación, las condiciones de crecimiento de cristales se deben volver a optimizar, ya que no existe un método confiable para la concentración de cristales de MP en LCP. Preparar la cantidad necesaria de LCP ordenada para ser utilizado para la dilución mediante la imitación de la composición de LCP (la misma de lípidos y precipitación) de la muestra original con cristales que necesita ser diluida. Mover todo LCP ordenada en una jeringa. Separar jeringa vacía pero dejar el acoplador conectado. Retire la aguja de la jeringa que contiene la muestra LCP con microcristales. Conectar la jeringa de la muestra a la jeringa que contiene LCP ordenada a través del acoplador. Mezclar el contenido de las jeringas empujándolo hacia atrás y adelante a través del acoplador hasta que se alcanza la homogeneidad. Repita la Sección 6 para volver a evaluar la densidad de microcristales en la muestra ajustada. 8. Inyector LCP Cargando unand LCP-SFX Recolección de Datos Desconectar el acoplador de la jeringa con la muestra y conecte una aguja 1 "de carga a la jeringa. Transferencia de 20 a 40 l de la muestra en el depósito de un inyector LCP. Inserte el inyector LCP en la cámara de muestra de 18, iniciar el inyector, ajustar la velocidad de flujo y recopilar datos LCP-SFX. 9. Incorporación de cristales de proteína soluble en LCP Nota: El uso de medios altamente viscosos, tales como LCP, para la entrega de los cristales de proteínas solubles le permite a uno para disminuir drásticamente el consumo de proteínas en un experimento de cristalografía de serie. En estos pasos se describe cómo incorporar cristales de proteínas solubles en LCP. Los cristales se pueden obtener por cualquier técnica, consolidado juntos en la forma de una suspensión de cristales y se filtra si es necesario. Ajustar la densidad de cristales en la suspensión para asegurar tasas de cristal de golpe de aproximadamente 10-40%. Test la compatibilidad de la solución precipitante con LCP utilizando 7,9 MAG, 9,7 MAG o una mezcla 1: 1 de 7,9 MAG y 9,9 MAG como lípido host. Mezclar ~ 25 l de la suspensión de cristales con ~ 25 l de la lípido anfitrión usando un mezclador de la jeringa hasta que se forma un LCP homogéneos. Evaluar el tamaño del cristal y la densidad como se describe en la Sección 6. Cargar la muestra en el inyector de LCP y recoger datos como se describe en la Sección 8.

Representative Results

A continuación se describen los resultados representativos obtenidos con muestras preparadas siguiendo los protocolos anteriores, lo que nos permitió recoger datos SFX y resolver las estructuras de alta resolución de cinco GPCR humanos: receptor de la serotonina 5-HT 2B en complejo con un ergotamina agonista 8 (AP ID 4NC3 ), receptor de smoothened (SMO) en el complejo con un ciclopamina antagonista 6 (AP ID 4O9R), el receptor δ-opioide en el complejo con un bi-funcional ligando peptídico DIPP-NH 2 7 (AP ID 4RWD), receptor de la angiotensina en el complejo con una bloqueador de ZD7155 9 (PDB ID 4YAY), y un complejo entre la rodopsina y arrestina 19 (PDB ID 4ZWJ); y dos pruebas proteínas solubles: lisozima (AP ID 4ZIX) y ficocianina (AP ID 4ZIZ). 5-HT 2B media en varias funciones fisiológicas centrales y periféricos de la serotonina, un neurotransmisor. Este receptorse utilizó para establecer y validar el método de LCP-SFX, mediante la comparación de la estructura de la temperatura ambiente obtenida en LCLS con la estructura cryocooled resuelto por microcrystallography tradicional en el Photon Source avanzada (APS). Se preparó un total de ~ 100 l de muestra LCP con microcristales de proteínas (tamaño medio de aproximadamente 5 micras) y se utiliza para la recolección de datos SFX, y la estructura LCP-SFX de 5HT 2B se resolvió con éxito en el 2,8 Å (Figura 2) 8. Detalles adicionales útiles en la preparación de muestras y recogida de datos se proporcionan en la Tabla 1. receptor Smoothened (SMO) es un miembro de la clase F GPCRs y el objetivo molecular de la ciclopamina teratógeno, con funciones bien demostrada en el desarrollo embrionario y el crecimiento tumoral. Inicialmente, se obtuvieron cristales relativamente grandes de SMO / ciclopamina con un tamaño medio de 120 × 10 × 5 micras y luego utilizados para collecti datosen a una fuente de sincrotrón utilizando cristalografía convencional a base de goniómetro. Sin embargo, estos grandes cristales producidos pobre de difracción en una línea de luz micro-enfoque (10 micras de diámetro) que sufren de gran mosaicidad (por encima de 2-3 grados), probablemente debido a la acumulación de defectos de crecimiento de cristal, o de los efectos relacionados con crioenfriamiento. LCP-SFX, sin embargo, nos permitió recoger los datos de difracción de calidad a partir de 5 LCLS cristales micras de tamaño a temperatura ambiente. La estructura se resolvió por reemplazo molecular a una anisotrópico 3.4, 3.2 y 4.0 Å de resolución a lo largo de los tres ejes principales, identificar claramente la ubicación de ciclopamina en la unión de bolsillo 6 (Figura 3). alcaloides opiáceos, como la morfina, dirigidos a un receptor opioide μ-(μ-O) son ampliamente utilizados para el manejo del dolor severo. Sin embargo, su uso extenso conduce a la tolerancia adquirida y la adicción. La coadministración de morfinascon antagonistas del receptor δ-opioide (δ-OR) se ha demostrado para prevenir los efectos secundarios antes mencionados, promoviendo así la búsqueda de compuestos con una función de δ-O-antagonista y μ-OR-agonista mixto. Se obtuvieron los datos de difracción iniciales en δ-OR en un complejo con un péptido tetra-bi-funcional DIPP-NH 2 usando cristales cryocooled que difractados a 3,3 Å a una fuente de rayos X de sincrotrón empleando estrategia de recolección de datos basados ​​en goniómetro convencional. Estos datos revelaron una densidad de electrones parcialmente ambigua para el ligando de péptido. Posteriormente, se obtuvieron datos de difracción XFEL a temperatura ambiente y se determinó la estructura en el 2,7 Å de resolución que muestra una densidad clara para el ligando y el receptor 7. Esta estructura ofrece una oportunidad para conocer otras funciones del receptor opioide comprensión y la selectividad y proporciona información valiosa para el desarrollo de nuevos analgésicos. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> angiotensina II tipo 1 receptor (AT 1 R) es un GPCR que actúa como un regulador primario de la presión arterial. Nos cristalizó a 1 R en el complejo con un antagonista de ZD7155 en LCP. Cristales optimizados alcanzaron un tamaño máximo de 40 x 4 x 4 m 3 con la mejor de difracción alcanzando sólo ~ 4 A a una fuente de sincrotrón. Al cambiar las condiciones de cristalización, se obtuvo una lluvia de cristales más pequeños (10 x 2 x 2 m 3), que se utilizaron para obtener la estructura temperatura ambiente a 2,9 Å de resolución, utilizando la radiación XFEL. Se recogieron un total de 2,764,739 imágenes del detector para hacer un conjunto completo de datos de alrededor de 65 l de LCP cristal cargado correspondientes a alrededor de 0,29 mg de proteína 9. Del número total de tramas, 457.275 fueron identificados como éxitos de cristal, que corresponde a una tasa de éxito del 17%, de los cuales 73,130 marcos (16% de aciertos) fueron indexados con éxito e integrados. GRAMOPCR señal a través de dos vías principales mediadas por proteínas o arrestinas G. La estructura de la β 2-adrenérgico receptor unido a la proteína A G heterotrimeric s se resolvió hace unos años 20, mientras que la estructura de un GPCR en complejo con arrestina había permanecido difícil de alcanzar. Se obtuvieron pequeños cristales de una proteína de fusión de la rodopsina-arrestina en LCP que alcanza 25-30 m en la dimensión más larga, pero a pesar de una amplia optimización, difractada sólo para ~ 7 Å de resolución en las fuentes de sincrotrón. Al utilizar el método de LCP-SFX, dentro de las 12 horas de tiempo de haz XFEL, se recogieron 22.262 accesos de cristal, de los cuales 18.874 se indicaron y patrones integrados para anisotrópico límites de resolución de 3,8 Å / 3.8 A / 3.3 a 19 con éxito. Rodopsina-arrestina es un complejo de proteínas muy difícil que resistió determinación de la estructura utilizando los enfoques tradicionales. La determinación exitosa de esta estructura ha demostrado el enorme potencial deel método LCP-SFX para hacer frente a problemas difíciles y proporcionó una oportunidad única para examinar el mecanismo de señalización arrestina-sesgada de los GPCR. Por último, además de la membrana cristales de proteínas cultivadas en la fase lipídica, nuestra preparación de la muestra y método de entrega se adaptó con éxito para cristales de proteínas solubles, donde se usa LCP como un medio de soporte para la entrega de los cristales, lo que nos permite reducir drásticamente el consumo de proteínas requerido para la determinación de la estructura. Estructuras de dos proteínas modelo, la lisozima y la ficocianina, se resolvieron a 1,89 Å y 1,75 Å de resolución, respectivamente, por este método, el uso de menos de 0,1 mg de cada proteína 21. La serotonina receptor 2B receptor de alisado <strong> Δ-receptor opioide Receptor de angiotensina II tipo 1 Rodopsina-Arrestin La lisozima ficocianina AP ID 4NC3 4O9R 4RWD 4YAY 4ZWJ 4ZIX 4ZIZ muestra utilizada total *, l 100 83 50 sesenta y cinco 75 10 10 La proteína total usado, g 300 500 300 290 340 100 100 El tamaño medio de cristal, micras 5 x 5 x 5 <5 5 x 2 x 2 10 x 2 x 2 5-10 5 x 2 x 2 10 x 10 x 5 Tasa de golpes,% 3.6 7.8 5.9 17 0.45 40 6.5 El tiempo total de recolección de datos, hr 10 8 4.6 6.4 12 0.75 0.67 Número de patrones indexadas 32819 61.964 36.083 73130 18.874 54.544 6.629 grupo espacial C 2 2 2 1 P 2 1 C 2 C 2 P 2 1 2 1 2 1 P 4 3 2 1 2 H 3 2 Resolución, Å 2.8 3,2 / 3,4 / 4,0 2.7 2.9 3,3 / 3,8 / 3,8 1.89 1.75 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> * Después de la valoración de los lípidos Tabla 1. Resumen de las estadísticas de preparación de muestras y recogida de datos de estructuras representativas resuelto utilizando el método de LCP-SFX. La cantidad de muestra requerido para un experimento LCP-SFX depende de la calidad de difracción de cristal, la densidad de cristal, el diámetro de la tobera del inyector, así como la tasa de repetición tamaño del haz XFEL, la intensidad y el pulso. Figura 1. Diagrama de flujo de un procedimiento de preparación de la muestra típico para preparación de muestras LCP-SFX. Comienza con la cristalización LCP de la proteína diana en jeringas de vidrio a los gases. Después de que se obtienen cristales, el LCP cristal cargado se consolida en una jeringa y se titula con lípido adicional, a ABSORb la solución precipitante exceso. A continuación, los cristales se caracterizan utilizando diversos métodos de microscopía anteriores a la recogida de datos XFEL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Un resultado representativo, la estructura del 5-HT 2B en el complejo con la ergotamina. (a) Microcristales de 5-HT 2B / ergotamina imágenes utilizando un modo de microscopio de campo brillante 8. Esta cifra se ha reutilizado de referencia 8 con el permiso de reproducción de la Ciencia. (B) los microcristales de 5-HT 2B / ergotamina fotografiado usando un modo de microscopio de polarización cruzada 8. Esta cifra se ha reutilizado de referencia 8 con el derecho de autorel permiso de la Ciencia. (c) Una representación de dibujos animados de la estructura 5-HT 2B / ergotamina obtenido por el método de LCP-SFX. Los lípidos que se construyeron en el modelo se muestran en la representación palo. La ergotamina ligando se muestra en la representación esferas. Las líneas continuas indican los límites aproximados de membrana. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Un resultado representativo, la estructura del SMO en complejo con ciclopamina. Panel izquierdo, microcristales de SMO / ciclopamina imagen usando un modo de microscopio de polarización cruzada 6. Esta cifra se ha reutilizado de la referencia 6, con el permiso de reproducción de Nature Communications. Panel de la derecha, un dibujo animado representatien la estructura de SMO / ciclopamina obtenida por el enfoque LCP-SFX. ciclopamina ligando se muestra en la representación esferas. Las líneas continuas indican los límites aproximados de membrana. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los protocolos descritos aquí proporcionan un esquema general del procedimiento de preparación de la muestra para un experimento estándar LCP-SFX con un inyector LCP. Basándonos en nuestra experiencia, el importe total de la muestra LCP microcristales cargado final requerido para la recogida de un conjunto de datos completo es típicamente 50-100 l (Tabla 1; 25-50 l de muestra inicial LCP proteína cargada), dependiendo del tamaño de los microcristales , la calidad y densidad. Dado que cada 100 l jeringa de vidrio hermético al gas puede acomodar sobre 7 l de LCP en la forma de una cadena totalmente extendida para garantizar la adecuada e incluso la difusión de la solución precipitante en el LCP, al menos cuatro a siete muestras en jeringas deben estar preparados para cada experimento LCP-SFX.

Dado que la muestra se extruye a través de un estrecho 20-50 micras de diámetro capilar, es crucial para evitar cualquier material de partículas extrañas en la muestra. Los polvos y fibras que podrían ser introducidos en ocasiones en el LCPsoluciones de muestra o precipitante puede obstruir el inyector capilar y aumentar el tiempo de inactividad durante el experimento. Por lo tanto, es importante para filtrar el lípido y todas las soluciones a través de un filtro de poro 5 micras antes de preparar las muestras. Opcionalmente, una habitación limpia o un portátil campana sala limpia se pueden utilizar para la preparación de muestras.

Estos protocolos se basan en el uso de 9,9 MAG (monooleına) como el anfitrión de lípidos MP cristalización. Ellos, sin embargo, no se limitan a 9,9 MAG y se pueden adaptar fácilmente a cualquier otros lípidos de acogida LCP o mezclas de lípidos después de tener en cuenta las diferencias en el comportamiento de fase de los lípidos. La mayor parte de las estructuras de los parlamentarios cristalizadas en LCP se obtuvieron utilizando una de las revistas, con 9,9 MAG ser el representante de mayor éxito hasta la fecha 15. El principal inconveniente de la utilización de 9,9 MAG para SFX es su transición a la fase cristalina lamelar al enfriar por debajo de 18 ° C, que a menudo se produce cuando la adquisición de datos se realiza en vacío. el titraticon 7,9 MAG se describe en la Sección 5 de este protocolo proporciona una buena solución a este problema. En nuestra experiencia, los cristales de soportar una valoración de este tipo sin ningún efecto adverso. Si, sin embargo, la adición de 7,9 MAG u otro MAG de cadena corta no es deseable, la valoración se puede realizar con 9,9 MAG. En este caso, el gas que estabiliza el flujo de LCP durante la inyección en el vacío debe ser conmutado de helio a nitrógeno, que puede prevenir la formación de una fase lipídica cristalina en la mayoría de las muestras, a expensas de tener un flujo de la muestra menos estable.

La consistencia similar a gel de LCP tiene una gran ventaja para su uso como un medio de soporte de cristal, ya que permite el ajuste de la velocidad de flujo de cristal a través de una amplia gama, adecuada para la recogida de datos de cristalografía de serie en modernas fuentes XFEL y sincrotrón. Adaptación de la velocidad de flujo de cristal con el pulso XFEL resultados de la tasa de repetición en la reducción dramática en el consumo de cristal en varios órdenes de magnitud compared a la inyección de líquido. LCP es un medio portador adecuado para la entrega no sólo de cristales MP cultivadas en ella, sino también para cristales de proteínas solubles de 21. Varios medios de transporte de cristal viscosos alternativos Recientemente se han introducido 22 – 24, que se extiende el arsenal de herramientas y reactivos para la realización de experimentos de cristalografía de serie. Por otra parte, la cristalografía de serie con LCP como un medio de entrega de cristal se ha demostrado en fuentes de sincrotrón convencionales, al menos por cristales bien de difracción 24,25. Las futuras actualizaciones de fuentes de sincrotrón que aumentan la intensidad de los rayos X en órdenes de magnitud, así como mejoras en la tecnología de detectores, harán que la cristalografía de serie un método aún más accesible y atractiva para la determinación de la estructura.

LCP-SFX ha demostrado su potencia durante MP determinación estructural. Para los sistemas biológicos difíciles (como GPCRs o complejos macromoleculares) donde Large, cristales de calidad de difracción son difíciles de cultivar, LCP-SFX puede proporcionar un atractivo, si no es la única opción viable para resolver una estructura de resolución atómica. Con todas sus ventajas, es decir, utilizando LCP como la matriz para MP cristalización y la entrega de cristal, bajo consumo de proteína, la ausencia de daño por radiación, sala de recogida de datos de temperatura, posibilidades de estudios de tiempo-resuelto 26,27 y ningún requisito cosecha cristal, LCP- SFX debe desempeñar un papel importante en el futuro de la biología estructural.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01 GM108635 y U54 GM094618, Premio de la Clínica Mayo-ASU colaboración de SEED Grant y NSF STC premio 1231306. Agradecemos a A. Walker para obtener ayuda con la preparación de manuscritos.

Materials

LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) Nu Chek Prep M239 Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) Sigma M7765  Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) Nu Chek Prep M219 Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid 7.9 MAG Avanti Polar Lipids 850534 Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection
Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/mL Target protein
Chloroform Fisher Scientific C606-1 Used to dissolve lipids
Methanol Sigma-Aldrich 179337-500ML Used to wash syringes
Eleven 100 mL Hamilton gas-tight syringes without needles Hamilton 7656-01 For LCP preparation
Eight syringe couplers Hamilton SKU 209526 For LCP preparation
Removable flat-tipped needle Hamilton 7804-01 For LCP dispensing
Parafilm Parafilm M', 250' x 2" Used for syringe sealing
Lint free lens cleaning tissues Fisher NC9592151
Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 mL, Durapore 5 µm Millipore UFC3 0SV 00 Used for filtering of precipitant solutions and lipids
Microscope slides, 1 inch x 3 inch  GoldSeal 3010
Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol VWR 89094-640 These are used to clean the syringes, needles and coupler.  Methanol is used first, then water.
Gloves Microflex XC-310-L For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers
Safety glasses
Pressurized air cans Office Depot (Dust-Off) 527494 For syringe cleaning
Dry block heater with a digital temperature controller Fisher 11-720-10BQ  Used for thawing lipids
Benchtop Centrifuge  Fisher 05-413-340 Spinning down solutions
Clean Room Mini – 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter Sentry Air Systems, Inc. SS-112-PCR Cleaning sample preparation
Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer  Nikon SMZ1500 Crystal density check
UV microscope JAN Scientific UVEX-P Optional, for crystal imaging purposes
SHG imager  Formulatrix SONICC Optional, for crystal imaging purposes
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References

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Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J. Vis. Exp. (115), e54463, doi:10.3791/54463 (2016).
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