הצמד תיקון הקלטות על Intact השורש הגבי הגרעינים מן חולדות בוגרות
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
מחקרים הצמד תיקון מן הגרעינים השורש הגבי (DRGs) נוירונים הגדילו את הבנתנו את מערכת העצבים ההיקפית. נכון לעכשיו, רוב ההקלטות נערכים בימים נוירונים DRG ניתק, המהווה הכנה סטנדרטית ברוב המעבדות. נכסים עצביים, לעומת זאת, ניתן לשנות על ידי פגיעת אקסונלית נובעת עיכול אנזים המשמש ברכישת נוירונים ניתקו. יתר על כן, הכנות נוירון ניתקות אינן יכולות לייצג את המיקרו-הסביבה של DRG מלא מאז אובדן ההתקשרות עם ותאי גלייה בלווין המקיפים את עצב סנסורי העיקרי היא תוצאה בלתי נמנעת של שיטה זו. כדי להתגבר על המגבלות בשימוש נוירונים DRG ניתק קונבנציונאלי עבור הצמד תיקון הקלטות, בדוח זה אנו מתארים שיטה להכין DRGs שלם לנהל הקלטות מהדק תיקון על עצב סנסורי עיקרי הפרט vivo לשעבר. גישה זו מאפשרת ההכנה המהירה וישירה של DRGs ללא פגע, מחקה בvivo התנאים על ידי שמירה על נוירונים DRG הקשורים ותאי גלייה בלוויין הסובבת אותם ואת קרום המרתף. יתר על כן, השיטה תמנע פגיעה אקסונלית ממניפולצית אנזים עיכול כגון כאשר dissociating DRGs. לשעבר זו הכנה vivo גם יכול לשמש כדי לחקור את האינטראקציה בין עצב סנסורי עיקרי ותאי גלייה בלוויין.
Introduction
הסנסציה חיונית ההישרדות ורווחתם של האורגניזם. את הלך הגירויים תלויה מסלולים החושיים החל מ הסופים היקפיים של אקסונים מן עצב סנסורי עיקרי. עצב סנסורי עיקרי, למעט גרעין mesencephalic של העצב הטריגמינלי, ממוקם גרעיני שורש בגרעיני הגבי trigeminal (DRGs). הם משמשים שומרי סף של המידע החושי 1. על הממברנה perikarial, כשם במסוף המרכזי ואת הפריפריה, נוירונים DRG לבטא קולטנים תעלות יונים, כגון קולטני גלוטמט, קולטני אלפא TNF, V subfamily ערוץ קטיון פוטנציאל חולף הקולטן חבר 1 (TRPV1), תעלות נתרן, וכו '2 -7. הצמד תיקון הקלטות של קרום perikarial לאפשר הבנת שינויים תפקודיים של רבים של קולטנים ערוצים אלה ברחבי הנוירון.
טכניקת הקלטת תיקון מהדק הוא כלי רב עצמה עבור סטיוגוסס הפעילויות של ערוצים או קולטני ומספר רב של מחקרים שנערכו על ידי החלת בטכניקה זו על נוירונים DRG 8-10. ברוב המחקרים DRG מוסר על ידי חיתוך שורשונים הגבי וקרוב עצבי השדרה אל הגנגליון. לאחר מיותר, גנגליון ממוקם מכן אנזימי עיכול כי לגרום דיסוציאציה של נוירונים DRG, וזה יכול אז יירשמו מייד או בתרבית למשך כמה ימים לפני ההקלטה. למרבה הצער, דיסוציאציה של נוירונים DRG כרוך axotomy צורך קרוב perikarya. לאחר הפרידו axotomized, נוירונים DRG עוברים שינויים פנוטיפי וכן שינויים רגישות הממברנה 11,12. ההפסד של קשר בין perikarya של נוירונים בודדים ואת ותאי גלייה בלווין שבדרך כלל מקיף אותם עשוי לתרום לשינויים אלה 13. ערב הדיבור בין נוירונים ותאי גלייה בלוויין הוא גם חיוני בתנאים פיזיולוגיים מאמצי ההסתגלות שלהם pathologתנאי iCal כגון אלה הגורמים לכאב סורר 14,15. זה יהיה מאתגר לחקור את האינטראקציה בין נוירונים ותאי גלייה בלוויין באמצעות תכשיר DRG ניתק.
DRGs השלם, מצד השני, לספק יותר לתנאי in vivo. בשנים האחרונות, במעבדה שלנו, כמו גם כמה קבוצות אחרות, כבר משתמשות DRGs ללא פגע מן החולדות בוגרות לחקור שינויים של עצב סנסורי עיקרי בתנאים שונים הקשורים כאב כרוני 3-5,11,15-17. למרות הטכניקות המשמשות במחקרים אלה מוקמות מעט, תיאור צעד אחר צעד טרם פורסם. בכתב היד הנוכחי, אנו מתארים בצורה נוחה ומהירה להכין DRGs שלמים והשימוש בהם עבור הצמד תיקון הקלטות.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מדווחים על שיטה להכין DRGs כולו ללימודי מהדק תיקון. ישנם מספר מרכיבים המרכזיים להכנת דגימה אידיאלית. ראשית, חשוב לנתח את DRGs עם שורשי גב מצורפים. לאחר מכן, epineurium צורך להסירו בזהירות תוך הימנעות נזק לתאי העצב. לבסוף, על מנת לחשוף את נוירונים ותאי גלייה בלוויין הסובבת א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just ‘rings around the neuron’. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neuroscience. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- Sherman-Gold, R. . The Axon Guide. , (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
