Patch Clamp Recordings op intacte ganglia van volwassen ratten
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
Patch clamp studies uit ganglia (DRG) neuronen hebben ons begrip van het perifere zenuwstelsel verhoogd. Momenteel zijn de meeste opnamen zijn uitgevoerd op gedissocieerd DRG neuronen, hetgeen een standaardpreparaat voor de meeste laboratoria. Neuronale eigenschappen kan echter worden veranderd door axonaal letsel door enzymdigestie gebruikt verwerven gedissocieerd neuronen. Verder kunnen gedissocieerd neuron preparaten niet geheel vertegenwoordigen de micromilieu van de DRG aangezien verlies van contact met satelliet gliacellen die de primaire sensorische neuronen omringen is een onvermijdelijk gevolg van deze methode. Om de beperkingen in het gebruik van conventionele los DRG neuronen voor patch clamp opnames, in dit verslag te overwinnen beschrijven we een methode om intacte DRG's voor te bereiden en uit te voeren patch clamp opnamen op de individuele primaire sensorische neuronen ex vivo. Deze aanpak maakt het mogelijk snel en eenvoudig de voorbereiding van intacte DRG's, het nabootsen invivo omstandigheden door het houden van DRG neuronen in verband met hun omgeving satelliet gliacellen en basaal membraan. Voorts vermijdt de werkwijze axonale verwonding door manipulatie en enzym digestie bijvoorbeeld wanneer dissociëren DRG. Dit ex vivo preparaat kan bovendien worden gebruikt om de interactie tussen primaire sensorische neuronen en gliacellen satelliet bestuderen.
Introduction
Sensation is essentieel om te overleven en het welzijn van een organisme. De transmissie van stimuli afhankelijk gevoelsbanen vanaf perifere uiteinden van axonen uit primaire sensorische neuronen. Primaire sensorische neuronen, met uitzondering van de mesencefale kern van de nervus vagus, bevinden zich in de nervus ganglia en dorsale wortel ganglia (DRG). Ze dienen als poortwachters van de sensorische informatie 1. Aan het perikarial membraan, net zoals bij de centrale en perifere terminals, DRG neuronen te uiten receptoren en ionkanalen, zoals glutamaat receptoren, TNF-alfa-receptoren, transient receptor potential kationenkanaal onderfamilie V lid 1 (TRPV1), natriumkanalen, etc. 2 -7. Patch clamp de perikarial membraan toestaan begrip functionele veranderingen van veel van deze receptoren en kanalen door het neuron.
De patch clamp opname techniek is een krachtig hulpmiddel voor stusterven de activiteiten van kanalen of receptoren en een groot aantal studies uitgevoerd door toepassing van deze techniek op DRG neuronen 8-10. In de meeste studies de DRG wordt verwijderd door het snijden van de dorsale worteltjes en spinale zenuwen dicht bij het ganglion. Na het hakken, wordt de ganglion vervolgens in spijsverteringsenzymen die resulteren in dissociatie van de DRG neuronen, dat kan vervolgens direct of gekweekt gedurende enkele dagen voor de opname opgenomen. Helaas, dissociatie van DRG neuronen behelst een noodzakelijke axotomy dichtbij de perikarya. Eenmaal los en geaxotomiseerde, DRG neuronen ondergaan fenotypische veranderingen en veranderingen in de membraan prikkelbaarheid 11,12. Het verlies van contact tussen de perikarya van individuele neuronen en de satelliet gliacellen die hen normaal gesproken omringen zal waarschijnlijk bijdragen aan deze veranderingen 13. De overspraak tussen neuronen en gliacellen satelliet zowel essentieel fysiologische omstandigheden en aanpassing aan patholoogical voorwaarden zoals die leidt tot hardnekkige pijn 14,15. Het is moeilijk om de interactie tussen neuronen en gliacellen satelliet met een gedissocieerde DRG preparaat bestuderen.
Intacte DRG, anderzijds bieden dichter bij in vivo omstandigheden. In de afgelopen jaren, heeft ons laboratorium, en andere groepen, gebruikt intacte DRG van volwassen ratten veranderingen van primaire sensorische neuronen in verschillende aandoeningen geassocieerd met chronische pijn 3-5,11,15-17 onderzoeken. Hoewel de in deze onderzoeken gebruikte technieken enigszins vastgesteld, stap voor stap beschreven is nog niet gepubliceerd. In de huidige manuscript beschrijven we een handige en snelle manier om intact DRG's en het gebruik ervan voor patch clamp opnames voor te bereiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij rapporteren een methode om hele DRG voor patch clamp studies voor te bereiden. Er zijn een aantal belangrijke elementen voor het bereiden van een ideaal exemplaar. Ten eerste is het belangrijk om de DRG ontleden met dorsale stukje wortel. Daarna moet de epineurium zorgvuldig worden verwijderd terwijl dat schade aan de neuronen. Ten slotte de neuronen en hun omgeving satelliet gliacellen blootgesteld, is het nodig om de resterende bindweefsel verteren. Intacte DRG van volwassen ratten bereid met de hier beschreven me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just ‘rings around the neuron’. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neuroscience. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- Sherman-Gold, R. . The Axon Guide. , (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
