Patch Clamp Recordings sur Intact ganglions rachidiens de rats adultes
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
Des études de patch-clamp de ganglions de la racine dorsale (DRG) neurones ont accru notre compréhension du système nerveux périphérique. À l'heure actuelle, la majorité des enregistrements sont effectués sur les neurones de DRG dissociés, ce qui est une préparation standard pour la plupart des laboratoires. propriétés neuronales, cependant, peuvent être modifiés par des lésions axonales résultant de la digestion enzymatique utilisée dans l'acquisition de neurones dissociés. En outre, les préparations de neurones dissociés ne peuvent pas représenter pleinement le microenvironnement de la DRG depuis la perte de contact avec les cellules gliales par satellite qui entourent les neurones sensoriels primaires est une conséquence inévitable de cette méthode. Pour surmonter les limitations dans l' utilisation de neurones classiques DRG dissociés pour les enregistrements de patch-clamp, dans ce rapport , nous décrivons une méthode pour préparer les DRG intactes et effectuer des enregistrements de patch-clamp sur les neurones sensoriels primaires individuels ex vivo. Cette approche permet la préparation rapide et simple des DRG intactes, imitant enconditions in vivo en gardant les neurones de DRG associés à leurs cellules gliales environnantes par satellite et de la membrane basale. En outre, le procédé permet d'éviter des lésions axonales de manipulation et de digestion avec une enzyme telle que lorsque les DRG dissociant. Cette préparation ex vivo peut en outre être utilisé pour étudier l'interaction entre les neurones sensoriels primaires et les cellules gliales par satellite.
Introduction
La sensation est essentielle à la survie et le bien-être d'un organisme. La transmission des impulsions dépend des voies sensorielles à partir des terminaisons périphériques des axones des neurones sensoriels primaires. neurones sensoriels primaires, à l'exception du noyau mésencéphalique du nerf trijumeau, sont situés dans les ganglions de la racine dorsale trijumeau (DRG). Ils servent en tant que gardiens de l'information sensorielle 1. À la membrane perikarial, tout comme au niveau des bornes centrales et périphériques, les neurones DRG expriment des récepteurs et des canaux ioniques, tels que les récepteurs du glutamate, récepteurs TNF alpha, le récepteur transitoire potentiel de canal de cations sous – famille V élément 1 (TRPV1), des canaux de sodium, etc. 2 -7. Enregistrements patch-clamp de la membrane perikarial permettent de comprendre les changements fonctionnels de plusieurs de ces récepteurs et des canaux à travers le neurone.
La technique d'enregistrement patch clamp est un outil puissant pour stumourir les activités des canaux ou des récepteurs et un grand nombre d'études ont été menées en appliquant cette technique sur les neurones DRG 8-10. Dans la plupart des études, le DRG est enlevé en coupant les radicelles dorsales et nerf spinal proche du ganglion. Après hachage, le ganglion est ensuite placé dans des enzymes digestives qui conduisent à la dissociation des neurones DRG, qui peuvent ensuite être enregistrées immédiatement ou mises en culture pendant plusieurs jours avant l'enregistrement. Malheureusement, la dissociation des neurones DRG implique une axotomie nécessaire près du péricaryons. Une fois dissociées et axotomisés, les neurones DRG subissent des modifications phénotypiques ainsi que des changements dans la membrane excitabilité 11,12. La perte de contact entre le péricaryons des neurones individuels et les cellules gliales par satellite qui entourent normalement eux est susceptible de contribuer à ces changements 13. La diaphonie entre les neurones et les cellules gliales par satellite est à la fois essentiel dans des conditions physiologiques et dans l'adaptation au pathologconditions iques telles que celles conduisant à la douleur intraitable 14,15. Il serait difficile d'étudier l'interaction entre les neurones et les cellules gliales par satellite en utilisant une préparation de DRG dissociés.
DRG intact, d'autre part, fournissent plus proche des conditions in vivo. Au cours des dernières années, notre laboratoire, ainsi que d'autres groupes, a eu recours à des DRG intacts de rats adultes pour étudier les changements de neurones sensoriels primaires dans différentes conditions associées à la douleur chronique 3-5,11,15-17. Bien que les techniques utilisées dans ces études sont peu établies, une description étape par étape n'a pas encore été publiée. Dans le présent manuscrit, nous décrivons un moyen pratique et rapide pour préparer les DRG intactes et leur utilisation pour les enregistrements de patch-clamp.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous rapportons une méthode pour préparer les DRG entiers pour les études de patch-clamp. Il y a plusieurs éléments clés pour préparer un spécimen idéal. Tout d'abord, il est important de disséquer les DRG avec des racines dorsales jointes. Après cela, le épinèvre doivent être soigneusement enlevés tout en évitant des dommages aux neurones. Enfin, afin d'exposer les neurones et les cellules gliales environnantes par satellite, il est nécessaire de digérer le tissu conjonctif restant. DRG Intact…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
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