Patch Clamp grabaciones en Intacto dorsal ganglios de la raíz de ratas adultas
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
Los estudios de pinzamiento zonal de los ganglios de la raíz dorsal (GRD) neuronas han aumentado nuestra comprensión del sistema nervioso periférico. Actualmente, la mayoría de las grabaciones se llevan a cabo en las neuronas DRG disociadas, que es una preparación estándar para la mayoría de los laboratorios. propiedades neuronales, sin embargo, pueden ser alterados por lesión axonal resultante de la digestión de la enzima utilizada en la adquisición de las neuronas disociadas. Además, las preparaciones de neuronas disociadas no puede representar completamente el microambiente de la DRG ya que la pérdida de contacto con las células gliales satélite que rodean a las neuronas sensoriales primarias es una consecuencia inevitable de este método. Para superar las limitaciones en el uso de las neuronas DRG disociadas convencionales para las grabaciones de patch clamp, en este informe se describe un método para preparar GRD intactas y realizar grabaciones de patch clamp en las neuronas sensoriales primarias individuales ex vivo. Este enfoque permite la preparación rápida y directa de los GRD intactas, imitando enVivo condiciones de mantenimiento de las neuronas DRG asociados a sus células capsulares circundantes y la membrana basal. Además, el método evita la lesión axonal de la manipulación y la digestión enzimática, tales como cuando disociar GRD. Esta preparación ex vivo, además, puede ser usado para estudiar la interacción entre las neuronas sensoriales primarias y células gliales satélite.
Introduction
La sensación es esencial para la supervivencia y el bienestar de un organismo. La transmisión de los estímulos depende de las vías sensoriales a partir de las terminaciones periféricas de los axones de las neuronas sensoriales primarias. neuronas sensoriales primarias, con la excepción del núcleo mesencefálico del trigémino, se encuentran en los ganglios de la raíz dorsal y ganglios del trigémino (GRD). Sirven como guardianes de la información sensorial 1. En la membrana perikarial, al igual que en los terminales centrales y periféricas, neuronas DRG expresan receptores y canales iónicos, tales como los receptores de glutamato, receptores de alfa TNF, receptor de potencial transitorio canal catiónico miembro de la subfamilia V 1 (TRPV1), los canales de sodio, etc. 2 -7. patch clamp grabaciones de la membrana perikarial permiten la comprensión de los cambios funcionales de muchos de estos receptores y canales a lo largo de la neurona.
La técnica de grabación de patch clamp es una poderosa herramienta para Stumorir las actividades de los canales o receptores y un gran número de estudios se han llevado a cabo mediante la aplicación de esta técnica en las neuronas DRG 8-10. En la mayoría de los estudios de los GRD se elimina mediante la reducción de las raicillas dorsal y los nervios cerca de la médula al ganglio. Después de picar, el ganglio se coloca entonces en las enzimas digestivas que resultan en la disociación de las neuronas DRG, que pueden entonces ser registrados inmediatamente o se cultivaron durante varios días antes de la grabación. Por desgracia, la disociación de las neuronas DRG implica una axotomía necesario cerca del pericarion. Una vez disociado y axotomizadas, neuronas DRG experimentan cambios fenotípicos, así como cambios en la excitabilidad de la membrana 11,12. La pérdida de contacto entre el pericarion de las neuronas individuales y las células gliales por satélite que normalmente rodean ellos es probable que contribuya a estos cambios 13. La diafonía entre las neuronas y las células gliales satélite es tanto esencial en condiciones fisiológicas y en la adaptación a pathological condiciones tales como las que conducen a dolor intratable 14,15. Sería un reto para estudiar la interacción entre las neuronas y las células gliales satélite que utilizan una preparación DRG disociado.
GRD intacto, por otra parte, proporcionan más cerca de las condiciones in vivo. En los últimos años, nuestro laboratorio, así como algunos otros grupos, ha estado utilizando GRD intactos de ratas adultas para investigar los cambios de las neuronas sensoriales primarias en diferentes condiciones asociadas con dolor crónico 3-5,11,15-17. Aunque las técnicas utilizadas en estos estudios se establecen tanto, una descripción paso a paso aún no ha sido publicada. En el presente manuscrito, se describe una forma cómoda y rápida de preparar GRD intactas y su uso para grabaciones de patch clamp.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presenta un método para preparar GRD enteros para los estudios de pinzamiento zonal. Hay varios elementos clave para la preparación de un espécimen ideales. En primer lugar, es importante para diseccionar los GRD con raíces dorsales conectados. Después de eso, el epineurio necesita ser eliminado cuidadosamente y evitar daños en las neuronas. Por último, para exponer las neuronas y sus células gliales circundantes satélite, es necesario para digerir el tejido conectivo restante. GRD intactos de ratas adultas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
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