Yetişkin Rats gelen bozulmamış Dorsal Kök Ganglia üzerinde Patch Kelepçe Kayıtlar
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
dorsal kök ganglionlar yama kelepçe çalışmaları (DRG) nöronlar periferik sinir sisteminin anlayışımızı artmıştır. Şu anda, kayıtların çoğunluğu çoğu laboratuvarlar için standart bir hazırlık ayrışmış DRG nöronlar üzerinde yapılmaktadır. Nöronal özellikleri, yine de, ayrışmış nöronların elde kullanılan enzim sindiriminden elde edilen aksonal yaralanma değiştirilebilir. birincil duyu nöronları çevreleyen uydu glial hücreleri ile temas kaybı bu yöntemin kaçınılmaz bir sonuçtur çünkü Dahası, ayrışmış nöron hazırlıkları tam DRG mikro temsil edemez. Bu raporda, yama kelepçe kayıtları için geleneksel ayrışmış DRG nöronlarını kullanarak sınırlamaları aşmak için biz sağlam DRG'ler hazırlamak ve bireysel primer duyu nöronlar ex vivo yama kelepçe kayıtları yapmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım içinde taklit, bozulmamış DRG'lerde hızlı ve basit hazırlık izinonların çevredeki uydu glial hücreler ve bazal membran ile ilişkili DRG nöronlarını tutarak koşulları vivo. Ayrıca, yöntem manipülasyon aksonal yaralanma önler ve bu tür DRG'ler dissociating olduğu gibi sindirim enzim. Ex vivo olarak preparat ek olarak birincil duyu nöronları ve uydu glial hücreler arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Duyum bir organizmanın hayatta kalması ve iyiliği için gereklidir. uyaranların iletimi birincil duyu nöronların akson periferal uçlarından başlayan duyu yollarıyla bağlıdır. Birincil duyu nöronları, trigeminal sinir mezensefalik çekirdeğin dışında, üçlü gangliyon ve dorsal kök ganglion (DRG) yer almaktadır. Bunlar duyusal bilginin 1 bekçisi olarak hizmet vermektedir. Perikarial membran, sadece santral ve periferal terminallerinde olduğu gibi, DRG nöronlar vb glutamat reseptörleri, TNF alfa reseptörleri, geçici reseptör potansiyeli katyon kanalı alt ailesi V üyesi 1 (TRPV1), sodyum kanallarının, 2 olarak reseptörler ve iyon kanallarını ifade -7. perikarial membran yama kelepçe kayıtları nöron boyunca bu reseptörlerin ve kanalların birçoğu fonksiyonel değişiklikleri anlamaya olanak sağlar.
yama kelepçe kayıt tekniği stu için güçlü bir araçtırkanal veya reseptörlerin ve çalışmaların çok sayıda faaliyetlerini ölen DRG nöronlar 8-10 bu tekniği uygulanarak yapılmıştır. Çalışmaların çoğunda DRG dorsal rootlets ve ganglion spinal sinir yakın kesilerek çıkarılır. Ufalamadan sonra ganglion daha sonra kayıttan önce birkaç gün hemen veya kültürlenmiş kaydedilebilir DRG nöronlarının, ayrışma neden sindirim enzimleri yerleştirilir. Ne yazık ki, DRG nöronlarının ayrışma perikaryada yakın gerekli Axotomy içerir. Bir kez ayrışmış ve axotomized, DRG nöronlar membran eksitabilite 11,12 fenotipik değişiklikler yanı sıra değişikliklere uğrarlar. Normalde onları çevreleyen bireysel nöronların perikaryada ve uydu glial hücreleri arasındaki temas kaybı bu değişikliklerden 13 katkıda muhtemeldir. nöronlar ve uydu glial hücreler arasındaki çapraz-karışma fizyolojik koşullarda önemli ve patholog adaptasyonda hemBöyle zorlu ağrı 14,15 lider gibi ical koşullar. Ayrışmış DRG hazırlık kullanarak nöronlar ve uydu glial hücreler arasındaki etkileşimi incelemek için zor olurdu.
Bozulmamış DRG Öte yandan, in vivo koşullarında daha yakın bulunur. Son birkaç yıl içinde, laboratuar, hem de başka bir grubu, kronik ağrı 3-5,11,15-17 ile bağlantılı farklı koşullarda birincil duyu nöronlarının değişiklikleri belirlemek amacıyla, yetişkin sıçanlardan sağlam DRG'ler kullanmaktadır. Bu çalışmalarda kullanılan teknikler biraz kurulmuş olmasına rağmen, bir adım-adım bir tanım yapılmamış yayımlanmamıştır. Mevcut yazıda, sağlam DRG'ler ve yama kelepçe kayıtları için kullanımını hazırlamak için uygun ve hızlı bir şekilde açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yama kelepçe çalışmaları için bütün DRG'ler hazırlamak için bir yöntem sunulmaktadır. İdeal numune hazırlamak için birkaç önemli unsur vardır. İlk olarak, ekteki dorsal kökleri DRG'ler incelemek için önemlidir. Bundan sonra, epinöriyuma nöronların zarar gelmesini de önler dikkatli bir şekilde çıkarılması gereklidir. Son olarak, nöronlar ve çevreleyen uydu glial hücreler ortaya çıkarmak için, kalan bağ dokusu sindirimi gereklidir. Burada tarif edilen yöntem ile hazırlana…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just ‘rings around the neuron’. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neuroscience. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- Sherman-Gold, R. . The Axon Guide. , (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
