Células Progenitoras de aislamiento Mesangiogenic (PSM) de Humana de Médula Ósea

NOTA: Después de consentimiento por escrito, se obtuvieron muestras de HBM durante la cirugía ortopédica de reemplazo de cadera. Inmediatamente después de la osteotomía del cuello femoral y antes femoral escariado una jeringa de 20 ml que contiene 500 UI de heparina, se utilizó para aspirar BM fresco. El protocolo debe ser considerado ampliamente aplicable a cualquier fuente BM. 1. Aislamiento del hueso humano células de la médula mononucleares (MNC HBM-) Diluir 5 – 10 ml de BM fresco a 50 ml, la aplicación de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) y se mezcla por inversión. Igualmente distribuir 25 ml en dos nuevos tubos de 50 ml cónicos, añadir 25 ml de D-PBS a cada tubo y mezclar por inversión. Permitir que los tubos en reposo durante 10 min a temperatura ambiente, para la separación de fragmentos de hueso minerales y grasa de la solución. Retirar con cuidado la grasa flotante con una suspensión de células pipeta Pasteur y el filtro estéril a través de filtros de 70 micras sin perturbar el sedimento fragmento de hueso mineral. <li> Establecer cuatro tubos de 50 ml con 15 ml de medio de centrifugación en gradiente de densidad discontinuo (1,077 g / ml). Asegúrese de que este medio es a temperatura ambiente. Coloque con cuidado 20 – 25 ml de BM diluida en la parte superior del medio de gradiente de densidad. Realice esta operación con cuidado, dejando goteo suspensión de células en las paredes del tubo para evitar que las capas de mezcla. Llevar a cabo la centrifugación en gradiente de densidad a 400 xg durante 30 min a temperatura ambiente con frenado está desactivado. Recoger el anillo blanquecino de células situadas entre las dos fases utilizando una pipeta Pasteur estéril y la transfiere a un nuevo tubo de 50 ml. Lavar las células con medio de cultivo fresco: libre de rojo fenol, nivel bajo de glucosa (1000 mg / l) de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) agrupado tipo AB de suero humano (Phab), 2 mM L-glutamina y antibióticos (DMEM / 10% Phab). Centrifugar a 400 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender en pellets de 5 – 10 ml de DMEM fresco / 10% Phab. Continúe con el recuento de células.Determinar el número de células blancas de la sangre por 1: 1 de dilución en tripano. Aplicar esto a la hemocitómetro, y observar con un microscopio de contraste de fase. Excluir eritrocitos pequeños y perfectamente redondeados y las células muertas teñidas de azul desde el recuento de células. NOTA: Se recomienda Phab pantalla lotes por su rendimiento en la recuperación de MPC. Phab de fuentes USA han dado mejores resultados mientras que la mayoría de los sueros de origen diferente resultó en culturas MPC con porcentajes más altos de células MSC-como. 2. Aislamiento del PSM de HBM-MNC Conjunto hidrófobos matraces T-75 con 15 ml de DMEM / 10% Phab y dejar que el pH y la temperatura se equilibran por pre-incubación a 37 ° C en 5% de CO2 durante 30 min. Semilla 4 – 6 x 10 7 HBM-MNC por matraz y se incuba a 37 ° C en 5% de CO2 durante 48 horas. Aspirar y desechar las células medianas y no adherentes de los matraces. Añadir 15 ml de DMEM / 10% Phab y se incuba a 37 ° Cen 5% de CO 2. Mantener los cultivos durante 6 – 8 días, cambiando el medio cada 48 horas. OPCIONAL: Para aumentar el rendimiento MPC, las células no adherentes de 2.3 podrían ser re-chapada en un nuevo frasco de cultivo y se mantienen como se describe para los cultivos primarios. Aspirar y descartar medio de los matraces, lavar con DMEM fresco y añadir 2 ml de solución de animales proteasa libre de desprendimiento. Se incuba a 37 ° C durante 5 – 15 min (evitar la incubación prolongada). Añadir 10 ml de DMEM fresco / 10% Phab, aspirar la suspensión de células y se centrifuga a 400 xg durante 5 min Aspirar y desechar el sobrenadante y volver a suspender sedimento en 1 – 2 ml de DMEM fresco / 10% Phab. Continúe con el recuento de células como se describe en el paso 1.10. NOTA: No utilice tripsina / EDTA como reactivo de desprendimiento. PSM son la tripsina resistentes. detección morfológica de las culturas, antes de la recolección de células, es muy recomendable con el fin de evaluar la presencia de células MSC-como en forma de huso. En caso considerable cantidad de células MSC-como son detected, aumentar la pureza del producto de células por la eliminación selectiva de las células contaminadas. Para ello, la digestión con tripsina se puede llevar a cabo antes de la recolección MPC, mediante la adición de 2 ml de tripsina / EDTA 0,05% durante 2 min. culturas de lavado dos veces con 5 ml de DMEM / 10% Phab, a continuación, proceder al tratamiento con proteasas que el anterior. 3. Caracterización de la célula Citometría de flujo Configurar las muestras duplicadas de 10 5 células recién desprendidas en la solución de lavado: D-PBS suplementado con 0,5% (v / v) de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,02% (w / v) de azida de sodio. Centrifugar a 400 xg durante 5 min. PRECAUCIÓN: La azida sódica es tóxica. Vuelva a suspender gránulos en 200 l de solución de lavado y añadir anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 y anti-CD31 anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes ( "test"); en paralelo configurar los controles de isotipo ( "CTRL"). NOTA: Las cantidades de tinción de anticuerpos deben determinarse mediante titulación o According con las instrucciones del fabricante. Incubar las muestras a 4 ° C durante 30 min. Centrifugar a 400 xg durante 5 min. Vuelva a suspender las células en 500 l de solución de lavado y adquirir al menos 5 x 10 4 eventos en el flujo multicolor citómetro 7 9 10. Analizar los resultados de dot-parcelas y utilizar "CTRL" eventos registrados para establecer cuadrantes. NOTA: Con el fin de definir la cultura como la cultura MPC el porcentaje de CD73 CD90 neg neg células CD31 + CD45 + debe ser superior al 95%. Para algunas aplicaciones específicas, es decir, el análisis de la expresión génica, la recuperación de corte tiene que ser aumentado a 97-98%. la detección y el análisis de la organización nestin F-actina Placa recién aisladas PSM en portaobjetos de cámara de cultivo (20.000 / cm2). Permitir que las células se adhieren por incubación durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2. Lavar las células en la solución de lavado y fix en 4% (w / v) para-formaldehído a temperatura ambiente durante 15 min. Para retirar el fijador, añadir la solución de lavado, se incuba durante 2 minutos y se vierte. Repetir el lavado dos veces. Permeabilizar células en D-PBS suplementado con 0,05% (v / v) de Triton X-100 durante 15 min a RT. Se interrumpe la reacción por la proteína potenciador libre de señal (30 min a RT) o solución de bloqueo estándar (D-PBS suplementado con 3% (w / v) BSA). Retire mejorador de señal / solución de bloqueo. Añadir 7 g / ml (w / v) de anticuerpo primario anti-nestina humano y se incuba a 4 ° C durante la noche en una cámara humidificada. Al mismo tiempo, utilizar anticuerpos de control isotıpicos para evaluar las señales de fluorescencia no específicos. Lavado de los portaobjetos mediante la adición de D-PBS, dejar durante 2 minutos y se vierte. Repetir dos veces. Añadir 2 g / ml (w / v) de colorante fluorescente anticuerpo secundario conjugado y se incuba a 4 ° C durante 1 hora en la oscuridad. Lavar los portaobjetos que el anterior. Añadir faloidina fluorescente (5 UI / ml), dejar a temperatura ambiente durante 30 men en la oscuridad y lavar 3 veces en D-PBS. Retire las paredes de la cámara y montar diapositivas en medio de montaje acuoso suplementado con antifade reactivo y 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la detección de núcleos. Proceder a la formación de imágenes 7 9 10. 4. Diferenciación de Mesengenic PSM Placa de 2 x 10 4 / cm2 PSM recién aisladas en frascos de cultivo T75 tratadas con TC y dejar que las células se adhieran durante la noche en DMEM / 10% Phab a 37 ° C en 5% de CO 2. Reemplazar DMEM / 10% Phab con medio de suero reducido estándar, alrededor de 200 l / cm 2, diseñado para la expansión de células mesenquimales del estroma (medio MSC-RS). Se cultivan las células hasta confluencia (P1-MSC), normalmente de 7 a 10 días después de la inducción. Refrescar el medio cada 2 días. Aspirar y descartar medio de los matraces, lavar con medio MSC-RS fresco y añadir 2 ml de solución de animales proteasa libre de desprendimiento. Incubar a 3776; C durante 5 – 15 min (evitar la incubación prolongada). Añadir 10 ml de medio de MSC-RS fresco, aspirar la suspensión de células y se centrifuga a 400 xg durante 5 min Aspirar el sobrenadante y resuspender pellet en 1 – 2 ml de medio MSC-RS fresco. Continúe con el recuento de células como se describe en el paso 1.10 Proceder a la sub-cultura de ellos mediante la siembra de 3 – 5 de 10 x 3 células / cm2. Se cultivan las células a confluencia (P2-MSC). Las células de la cosecha por la digestión de la proteasa como se describe en el paso 4.3 al paso 4.5 y proceder a la caracterización como se describe en la sección 3. NOTA: Un porcentaje de células CD31 neg neg CD73 + CD90 + CD45 menor que 95% indicaría solamente la diferenciación parcial y requieren de un paso de cultivo más. Placa P2-MSC a 2 x 10 4 / cm2 en placas de seis pocillos tratados con TC y crecer hasta la confluencia en medio MSC-RS. Marque dos pozos como "No Dif" y refrescar medio MSC-RS. Marca de los dos, asís como "Osteo" y reemplazar medio con 200 l / cm 2 de medio osteogénico estándar, diseñado específicamente para la diferenciación de MSC. Marque dos pozos como "Adipo" y reemplazar medio con 200 l / cm2 de medio adipogénico estándar, diseñado específicamente para la diferenciación de MSC. Mantener los cultivos a 37 ° C en 5% de CO 2 al cambiar el conjunto de los medios de comunicación cada 48 horas. NOTA: Se recomienda utilizar los medios diferenciadores estándar disponibles comercialmente para la reproducibilidad de los ensayos. Después de 2/3 semanas bajo condiciones de diferenciación, los depósitos de calcio aparecen en las culturas osteogénicas inducida, mientras que la acumulación de lípidos intracelulares gotitas es evidente en las células adipogénicas inducida. Aspirar y descartar los medios de cultivo y luego se lavan con D-PBS. Fijar los cultivos mediante la adición de 1 ml de 4% (w / v) para-formaldehído durante 15 min a temperatura ambiente. Para retirar el fijador añadir D-PBS, se incuban durante 2 minutos y se vierte. Repetir el lavadodos veces. Manchar uno "Sin Dif", junto con los dos "Osteo" marcó pozos en solución fluorescente específica hidroxiapatita y uno "Sin Dif", junto con los dos "Adipo" marcó pozos en 200 nM solución de Rojo Nilo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente 11,12. Retire las soluciones de tinción y lavar en D-PBS dos veces. Eliminar D-PBS, añadir D-PBS suplementado con 50% (v / v) de glicerina y proceder a la imagen 7 9 10. 5. MPC esferoide del brote Ensayo Para producir esferoides 3D, coloque 20 gotas l de suspensión recién aisladas MPC (1,5 x 10 4 células / gota) en la superficie interna de una tapa de placa de Petri. NOTA: Como gotas de manipulación podría conducir a su ruptura, es altamente recomendable para ponerlas en exceso. Con cuidado, usar la tapa para recapitular una placa de Petri que contiene D-PBS para evitar la evaporación cae colgante. Incubar a 37 ° C en 5% de CO 2durante la noche para permitir que las células se agregan en esferoides 3D. Establecer un gel espeso de las proteínas murinas matriz extracelular (ECM) mediante la adición de 300 ml de alícuotas de proteínas ECM estándar en una placa de cultivo de pre-refrigerada de 24 pocillos, y se incuba a 37 ° C durante 30 minutos. incline con cuidado sobre la tapa placa de Petri y suavemente recoger los esferoides utilizando una pipeta Pasteur estéril. Coloque esferoides en el gel de proteínas ECM, añadir 700 ml de alícuotas de medio de crecimiento de células endoteliales VEGF-rica estándar e incubar a 37 ° C en 5% de CO 2. Después de 24 horas ya los 7 días de cultivo, tomar fotografías de las culturas 3D en una potencia de magnificación 4X. Evaluar la brotación de esferoides que aplican el software de análisis de imágenes mediante la medición de la distancia radial entre la última célula invasora y el borde esferoide. Repetir las medidas a lo largo de al menos 20 direcciones diferentes. La media distancia se considera como positiva cuando 50 micras o más.