Isolieren von Mesangiogenic Progenitorzellen (MPL) aus menschlichem Knochenmark

HINWEIS: Nach der schriftlichen Zustimmung HBM Proben wurden während der orthopädischen Chirurgie für Hüftoperation erhalten. Unmittelbar nach dem Oberschenkelhals Osteotomie und vor femoralis eine 20-ml-Spritze, die 500 UI von Heparin Aufreiben, verwendet wurde frisch BM abzusaugen. Das Protokoll ist allgemein anwendbar auf jede BM Quelle betrachtet werden. 1. Isolierung von menschlichem Knochenmark mononukleären Zellen (HBM-MNU) Verdünnte von 5 bis 10 ml frischem BM bis 50 ml, Aufbringen Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) und durch Invertieren mischen. verteilen Ebenso 25 ml in zwei neue 50 ml konische Röhrchen, 25 ml D-PBS zu jedem Röhrchen und mischen durch Umdrehen. Ermöglichen die Röhrchen für 10 min bei Raumtemperatur stehen, zur Trennung mineralischer Knochenfragmenten und Fett aus der Lösung. Entfernen Sie vorsichtig mit einer sterilen Pasteur-Pipette und Filterzellsuspension durch 70 & mgr; m Filter ohne Störung des Mineralknochenfragment Pellet Floating Fett. <li> Stellen Sie vier 50-ml-Röhrchen mit 15 ml Medium für diskontinuierliche Dichtegradientenzentrifugation (1,077 g / ml). Stellen Sie sicher, dass dieses Medium bei Raumtemperatur ist. Sanft legen 20 bis 25 ml verdünntem BM oben auf Dichtegradientenmedium. Diese Operation sorgfältig Zellsuspension trickle an den Rohrwänden zu lassen Mischungsschichten zu verhindern. Durchführung Dichtegradienten Zentrifugation bei 400 xg für 30 min bei Raumtemperatur mit Bremse deaktiviert. Sammeln Sie die weißlich Ring zwischen den beiden Phasen befindlichen Zellen mit einer sterilen Pasteurpipette und übertragen sie in ein frisches 50-ml-Tube. Wasche die Zellen mit frischem Kulturmedium: Phenolrot-frei, niedrige Glukose (1000 mg / l) nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10% (v / v) gepooltem humanem AB-Typ-Serum (PhAbs), 2 mM L-Glutamin und Antibiotika (DMEM / 10% PhAbs). Zentrifuge bei 400 × g für 5 min. Überstand entfernen und wieder auszusetzen Pellet in 5-10 ml frischem DMEM / 10% PhAbs. Fahren Sie mit Zellzahl.Bestimmen Sie die Anzahl der weißen Blutkörperchen durch 1: 1-Verdünnung in Trypanblau. Wenden Sie diese auf die Zählkammer und beobachten unter einem Phasenkontrastmikroskop. Ausschließen klein und perfekt abgerundeten Erythrozyten und blau gefärbten toten Zellen aus der Zellzahl. HINWEIS: Es wird dringend für ihre Leistung in MPC Recovery Bildschirm PhAbs Chargen empfohlen. PhAbs aus den USA Quellen haben die besten Ergebnisse, während die meisten Seren unterschiedlicher Herkunft in MPC Kulturen mit höheren Anteilen von MSC-ähnlichen Zellen resultierte gegeben. 2. Isolierung von MPL von HBM-MNU Set hydrophobe T-75 – Kolben mit 15 ml frischem DMEM / 10% PhAbs und lassen pH und Temperatur durch Vorinkubation in 5% CO 2 für 30 min bei 37 ° C äquilibrieren. Seed 4 – 6 x 10 7 HBM-MNU pro Kolben und Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 für 48 Stunden. Absaugen und Medium und nicht haftenden Zellen aus den Kolben zu verwerfen. 15 ml frischem DMEM / 10% PhAbs und Inkubation bei 37 ° Cin 5% CO 2. Pflegen Kulturen für 6 – 8 Tage Mediumwechsel alle 48 Stunden. OPTIONAL: MPC Rendite, nicht haftenden Zellen von 2,3 zu erhöhen, erneut plattiert in einem neuen Kulturflasche und gepflegt für die Primärkulturen wie beschrieben werden könnte. Absaugen und entsorgen Medium aus den Kolben, waschen mit frischem DMEM und 2 ml freier Protease Tier Ablösen Lösung. bei 37 ° C inkubieren 5 bis 15 min (Vermeidung längerer Inkubation). 10 ml frischem DMEM / 10% PhAbs absaugen Zellsuspension und Zentrifuge bei 400 xg für 5 min Absaugen und Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren Pellet in 1 bis 2 ml frischem DMEM / 10% PhAbs. Fahren Sie mit Zellzahl, wie in Schritt 1.10 beschrieben. HINWEIS: Verwenden Sie Trypsin / EDTA nicht als Reagenz löst. MPCs sind Trypsin resistent. Morphologische Screening der Kulturen, vor der Zellernte, wird dringend empfohlen, um das Vorhandensein von spindelförmigen MSC-ähnlichen Zellen zu bewerten. Im Falle beträchtliche Menge an MSC-ähnlichen Zellen sind detected, erhöhen die Reinheit des Zellprodukt durch selektives die verunreinigten Zellen zu entfernen. Dazu kann Trypsinverdaus vor durchgeführt werden, um MPC Ernte, durch Zugabe von 2 ml Trypsin / EDTA 0,05% für 2 min. Wasch Kulturen zweimal mit 5 ml DMEM / 10% PhAbs, dann gehen die Behandlung wie oben Protease ist. 3. Zell Characterization Durchflusszytometrie Einrichten Doppelproben von 10 5 frisch abgelösten Zellen in Waschlösung D-PBS ergänzt mit 0,5% (v / v) Rinderserumalbumin (BSA) und 0,02% (w / v) Natriumazid. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min. ACHTUNG: Natriumazid ist giftig. Re-suspendieren Pellets in 200 ul Waschlösung und fügen anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 und anti-CD31-Antikörper, konjugiert mit fluoreszierendem Farbstoffen ( "Test"); parallel Isotypkontrollen einrichten ( "CTRL"). HINWEIS: Die Mengen Antikörper-Färbung sollte durch Titration oder accor bestimmt werdending den Anweisungen des Herstellers. Inkubieren Proben bei 4 ° C für 30 min. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min. Re-suspendieren Zellen in 500 & mgr; l Waschlösung und erwerben mindestens 5 x 10 4 Ereignissen auf Mehrfarben Durchflusszytometer 7 9 10. Analysieren Ergebnisse durch Dot-Plots und mit "CTRL" aufgezeichneten Ereignisse Quadranten zu setzen. HINWEIS: Um die Kultur als MPC Kultur der Anteil der CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + Zellen zu definieren , sollte mehr als 95% betragen. Für einige spezifische Anwendungen, dh Genexpressionsanalyse hat der Wiederherstellungs cut-off bis 97 erhöht werden – 98%. Nestin Erkennung und F-Actin-Organisation Analyse Teller frisch isolierten MPCs auf Kulturkammer Dias (20.000 / cm 2). Erlauben Zellen durch Inkubation über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2 anhaften. Wash-Zellen in Waschlösung und fix in 4% (w / v) Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 15 min. Zum Entfernen Fixiermittel Waschlösung hinzufügen, Inkubation für 2 Minuten und gießen. Wiederholen Waschen zweimal. Permeabilisieren Zellen in D-PBS, supplementiert mit 0,05% (v / v) Triton X-100 für 15 min bei RT. Stopp-Reaktion durch Protein freien Signalverstärker (30 min bei RT) oder Standard-Blockierungslösung (D-PBS, ergänzt mit 3% (w / v) BSA). Entfernen Sie Signalverstärker / Blocking-Lösung. ADD 7 & mgr; g / ml (w / v) von anti-humanen Nestin primären Antikörper und Inkubieren bei 4 ° C über Nacht in einer befeuchteten Kammer. Parallel dazu verwenden Isotypiekontrolle Antikörper keine spezifischen Fluoreszenzsignale zu bewerten. Waschen Sie gleitet durch D-PBS Zugabe, lassen für 2 Minuten und gießen. Zweimal wiederholen. Fügen Sie 2 & mgr; g / ml (w / v) der Fluoreszenzfarbstoff konjugierten sekundären Antikörper und Inkubieren bei 4 ° C für 1 Stunde im Dunkeln. Wash gleitet wie oben. In fluoreszierenden Phalloidin (5 UI / ml), lassen bei RT für 30 min im Dunkeln und wasche 3mal in D-PBS. Entfernen Sie die Kammerwände und montieren Folien in wässrigen Eindeckmittel mit Antifade Reagenz ergänzt und 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) für Kerne Erkennung. Gehen Sie 7 9 10 bis Bildgebung. 4. Mesengenic Differenzierung von MPL Plate 2 x 10 4 / cm 2 frisch isolierten MPCs in TC-behandelt T75 Kulturflaschen und lassen Zellen anhaften über Nacht in DMEM / 10% PhAbs bei 37 ° C in 5% CO 2. Ersetzen DMEM / 10% PhAbs mit Standard reduzierten Serummedium, etwa 200 & mgr; l / cm 2, bestimmt für mesenchymale Stromazellen Expansion (MSC-RS – Medium). Zellen wachsen zu Konfluenz (P1-MSCs), typischerweise von 7 bis 10 Tagen von der Induktion. Aktualisieren Medium alle 2 Tage. Absaugen und entsorgen Medium aus den Kolben, waschen mit frischem MSC-RS-Medium und 2 ml freier Protease Tier Ablösen Lösung. Inkubieren bei 3776; C für 5 bis 15 min (Vermeidung längerer Inkubation). 10 ml frisch MSC-RS Medium absaugen Zellsuspension und Zentrifuge bei 400 xg für 5 min Überstand entfernen und wieder auszusetzen Pellet in 1 bis 2 ml frischem MSC-RS Medium. Fahren Sie mit Zellzahl wie in Schritt 1.10 Gehen Sie zur Subkultur sie durch Impfen von 3 bis 5 x 10 3 Zellen / cm 2. Wachsen Zellen bis zur Konfluenz (P2-MSCs). Ernten Sie die Zellen durch Protease Verdauung von Schritt beschrieben 4.3 4.5 zu Schritt und Charakterisierung gehen Sie wie in Abschnitt 3 beschrieben. HINWEIS: Ein bestimmter Prozentsatz von CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg Zellen weniger als 95% würden nur eine partielle Differenzierung zeigen und eine weitere Kulturpassage erfordern. Platte P2-MSCs bei 2 x 10 4 / cm 2 in sechs gut TC-behandelten Platten und wachsen in MSC-RS – Medium bis zur Konfluenz. Mark zwei Brunnen als "No Diff" und aktualisieren Sie MSC-RS Medium. Mark zwei guts als "Osteo" und ersetzen Medium mit 200 & mgr; l / cm 2 von Standard osteogenen Medium, die speziell für die Differenzierung MSC konzipiert. Mark zwei Brunnen als "Adipo" und ersetzen Medium mit 200 & mgr; l / cm 2 von Standard adipogenetische Medium, das speziell für die MSC – Differenzierung. Pflegen Kulturen bei 37 ° C in 5% CO 2 von der gesamten Medien jede 48 Stunden ändern. HINWEIS: Es ist sehr kommerziell erhältlichen Standard Differenzierungsmedien für Test Reproduzierbarkeit empfohlen zu verwenden. Nach 2/3 Wochen unter Differenzierungsbedingungen, erscheinen Kalziumablagerungen in den Kulturen osteogenen induziert, während die intrazelluläre Akkumulation Lipidtröpfchen in adipogenetische induzierten Zellen zu erkennen ist. Absaugen und entsorgen Kulturmedien waschen dann mit D-PBS. Fix die Kulturen durch Zugabe von 1 ml von 4% (w / v) Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur. Zum Entfernen Fixiermittel hinzufügen 2 min D-PBS, Inkubation und gießen. Wiederholen Waschenzweimal. Stain ein "Nein Diff" zusammen mit den beiden "Osteo" Brunnen markiert in Hydroxyapatit spezifische fluoreszierende Lösung und ein "Nein Diff" zusammen mit den beiden "Adipo" Brunnen markiert in 200 nM Nile Red-Lösung. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur 11,12. Entfernen Sie Lösungen Färbung und waschen in D-PBS zweimal. Entfernen D-PBS, fügen D-PBS , ergänzt mit 50% (v / v) Glycerin und fahren Sie mit Imaging – 7 9 10. 5. MPC Sphäroid Sprouting Assay Zur Herstellung von 3D – Sphäroiden, lag 20 ul Tropfen frisch isolierten MPC – Suspension (1,5 x 10 4 Zellen / Tropfen) auf der inneren Oberfläche der Petrischale mit Deckel. HINWEIS: Handhabung Tropfen zu ihren Bruch führen könnten, ist es sehr empfehlenswert ist, sie über zu legen. Verwenden Sie den Deckel vorsichtig eine Petrischale mit D-PBS zu rekapitulieren hängenden Tropfen Verdunstung zu verhindern. Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2über Nacht Zellen zu ermöglichen in 3D Sphäroide zu aggregieren. Legen Sie ein dickes Gel von murinen extrazellulären Matrix (ECM) Proteine ​​durch Zugabe von 300 ul Aliquots von Standard-ECM-Proteine ​​in einem vorgekühlte 24-Well-Kulturplatte, und bei 37 ° C für 30 min. Vorsichtig die Schalendeckel Petri umkippen und sanft die Sphäroiden mit einer sterilen Pasteur-Pipette abholen. Lay Sphäroiden auf das ECM – Protein – Gel, fügen 700 ul Aliquots von Standard – VEGF-reiche endothelialen Zellwachstumsmedium und Inkubation bei 37 ° C in 5% CO 2. Nach 24 Stunden und 7 Tage der Kultur, machen Sie Fotos von der 3D-Kulturen bei Vergrösserungs 4X. Auswerten von Sphäroiden sprießen die Anwendung der Bildanalyse-Software durch den radialen Abstand zwischen dem letzten eindringenden Zelle und dem Sphäroid Kante zu messen. Wiederholungsmaßnahmen entlang mindestens 20 verschiedenen Richtungen. Der mittlere Abstand wird als positiv angesehen, wenn 50 & mgr; m oder mehr beträgt.