Isoleren Mesangiogenic Progenitor Cells (MTR) van Human Bone Marrow

NB: Na schriftelijke toestemming, werden HBM monsters verkregen tijdens orthopedische chirurgie voor heupprothese. Direct na femorale hals osteotomie en voor femorale ruimen een 20 ml spuit met 500 UI heparine, werd gebruikt om vers BM zuigen. Het protocol is breed toepasbaar op elke BM bron worden beschouwd. 1. Isolatie van Human Bone Marrow mononucleaire cellen (HBM-multinationals) Verdun 5-10 ml vers BM 50 ml, toepassing Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) en meng door omkeren. Verdeel eveneens 25 ml in twee nieuwe 50 ml conische buizen, voeg 25 ml D-PBS aan elke buis en meng door omkeren. Laat de buizen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur staan, voor het scheiden van minerale botfragmenten en vet uit oplossing. Verwijder voorzichtig drijvende vet met een steriele Pasteur pipet en filter celsuspensie door middel van 70 micrometer filters zonder verstoring van de mineraal bot fragment pellet. <li> Stel vier 50 ml buizen met 15 ml medium voor discontinue dichtheidsgradiënt centrifugatie (1,077 g / ml). Zorg ervoor dat dit medium bij kamertemperatuur. Leg zacht 20-25 ml verdund BM op de top van dichtheidsgradiënt medium. Voer deze operatie zorgvuldig, zodat celsuspensie trickle op de buis muren om het mengen van lagen te voorkomen. Voeren dichtheidsgradiënt centrifugatie bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur met rem uitgeschakeld. Verzamel de witachtige ring van cellen die zich tussen de twee fasen met een steriel pasteurpipet en overgebracht naar een verse 50 ml buis. Was de cellen met vers kweekmedium: fenolrood-vrij, laag glucose (1000 mg / l) Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) samengevoegd humaan type AB serum (PhABS), 2 mM L-glutamine en antibiotica (DMEM / 10% PhABS). Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten. Zuig supernatant en resuspendeer pellet in 5-10 ml vers DMEM / 10% PhABS. Ga verder met celgetal.Bepaal het aantal witte bloedcellen door 1: 1 verdunning in trypan. Breng dit aan de hemocytometer en observeren onder een fasecontrastmicroscoop. Uitsluiten klein en perfect afgeronde erytrocyten en blauw-gekleurde dode cellen van het aantal cellen. LET OP: Het wordt sterk aanbevolen om het scherm PhABS partijen voor hun prestaties in MPC herstel. PhABS uit de VS bronnen hebben het beste resultaat gegeven, terwijl de meeste sera van verschillende afkomst resulteerde in MPC kweken met hogere percentages van MSC-achtige cellen. 2. Isolatie van mediterrane partnerlanden van HBM-multinationals Set hydrofobe T-75 kolven met 15 ml vers DMEM / 10% PhABS en laat pH en temperatuur evenwicht door pre-incubatie bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 30 minuten. Seed 4-6 x 10 7 HBM-MDL per kolf en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 48 uur. Zuig en gooi middelgrote en niet-hechtende cellen uit flessen. Voeg 15 ml vers DMEM / 10% PhABS en incubeer bij 37 ° Cin 5% CO2. Handhaaf culturen 6-8 dagen, veranderen medium elke 48 uur. Optioneel: MPC opbrengst te verhogen, niet-hechtende cellen van 2,3 opnieuw kunnen worden uitgeplaat in een nieuwe kolf en gehandhaafd zoals beschreven voor de primaire kweken. Zuig en gooi medium uit flessen, wassen met verse DMEM en voeg 2 ml van dierlijke vrije protease losmaken oplossing. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 – 15 min (vermijd verlengde incubatie). Voeg 10 ml vers DMEM / 10% PhABS, zuigen de celsuspensie en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten Zuig en gooi supernatant en resuspendeer pellet in 1-2 ml vers DMEM / 10% PhABS. Ga verder met celgetal zoals beschreven in stap 1.10. LET OP: Gebruik geen trypsine / EDTA als los reagens. MTR zijn trypsine resistent. Morfologische screening van de culturen vóór verzamelen van cellen, wordt sterk aanbevolen om de aanwezigheid van spoelvormige MSC-achtige cellen te evalueren. Bij aanzienlijke hoeveelheid MSC-achtige cellen detected, verhoging van de zuiverheid van het celproduct door het selectief verwijderen van de besmette cellen. Hiervoor trypsine digestie kan worden uitgevoerd voordat MPC oogsten uitgevoerd door toevoeging van 2 ml trypsine / EDTA 0,05% gedurende 2 minuten. Was de cultures tweemaal met 5 ml DMEM / 10% PhABS, ga dan verder met de behandeling zoals hierboven protease. 3. Cell karakterisering flowcytometrie Opgericht duplo monsters van 10 5 vers losgemaakte cellen in wasoplossing: D-PBS aangevuld met 0,5% (v / v) runderserumalbumine (BSA) en 0,02% (w / v) natriumazide. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten. LET OP: Natriumazide is giftig. Resuspendeer pellets in 200 pl wasoplossing en voeg anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 en anti-CD31-antilichamen geconjugeerd met fluorescente kleurstoffen ( "test"); parallel opgezet isotype controles ( "CTRL"). LET OP: Bedragen van kleuring antilichamen moet worden bepaald door titratie of According instructies van de fabrikant. Incubeer monsters bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten. Re-schorten cellen in 500 pi wasoplossing en het verwerven van ten minste 5 x 10 4 evenementen op multicolor flowcytometer 7 9 10. Analyseer resultaten op dot-plots en gebruik "CTRL" opgenomen gebeurtenissen te kwadranten te stellen. Opmerking: Om de cultuur als MPC cultuur definieert het percentage van CD73 neg neg CD90 CD45 + CD31 + cellen moet meer dan 95%. Voor sommige specifieke toepassingen, dat wil zeggen analyse van genexpressie, het herstel cut-off moet worden verhoogd tot 97-98%. Nestin detectie en F-actine organisatie analyse Plaat vers geïsoleerde MTR over cultuur kamer dia's (20.000 / cm2). Sta cellen hechten door overnacht incubatie bij 37 ° C in 5% CO2. Was de cellen in wasoplossing en fix in 4% (w / v) paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Voor het verwijderen van fixerende toevoegen wasoplossing, incubeer gedurende 2 minuten en giet. Herhaal het wassen tweemaal. Doorlaatbaar cellen in D-PBS aangevuld met 0,05% (v / v) Triton X-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Stop reactie door eiwitvrije signaal versterker (30 min bij kamertemperatuur) of standaard blokkerende oplossing (D-PBS gesupplementeerd met 3% (w / v) BSA). Verwijder signaal versterker / blokkeren oplossing. Voeg 7 ug / ml (w / v) anti-humaan nestine primair antilichaam en incuberen bij 4 ° C geïncubeerd in een bevochtigde kamer. Daarnaast gebruiken isotype controle antilichamen niet specifiek fluorescentiesignalen evalueren. Was de dia's door het toevoegen van D-PBS, laat gedurende 2 minuten en giet. Herhaal dit twee keer. Voeg 2 ug / ml (w / v) van fluorescente kleurstof geconjugeerd secundair antilichaam en incuberen bij 4 ° C gedurende 1 uur in het donker. Was de dia's zoals hierboven. Voeg fluorescerende Phalloidin (5 UI / ml), vertrekken bij KT 30 min in het donker en was 3 maal in D-PBS. Verwijder de kamerwanden en dia monteren montage waterig medium aangevuld met antifade reagens en 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) voor detectie kernen. Ga verder met het afbeelden van 7 9 10. 4. Mesengenic Differentiatie van MTR Plaat 2 x 10 4 / cm 2 vers geïsoleerde MPL in TC behandelde T75 kweekflessen en laat cellen zich overnacht in DMEM / 10% PhABS bij 37 ° C in 5% CO2. Vervang DMEM / 10% PhABS met standaard gereduceerd serum medium, ongeveer 200 pl / cm2, ontworpen voor mesenchymale stromale cellen expansie (MSC-RS gemiddeld). Cellen groeien tot confluentie (P1-MSC's), kenmerkend van 7 tot 10 dagen na de inductie. Vernieuwen medium om de 2 dagen. Zuig en gooi medium uit flessen, wassen met verse MSC-RS medium en voeg 2 ml van dierlijke vrije protease losmaken oplossing. Incubeer bij 3776; C gedurende 5 – 15 min (vermijd langdurige incubatie). Voeg 10 ml van verse MSC-RS medium, zuigen de celsuspensie en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten Zuig supernatant en resuspendeer pellet in 1-2 ml vers MSC-RS medium. Ga verder met celgetal zoals beschreven in stap 1.10 Ga verder met subcultuur hen door zaaien 3-5 x 10 3 cellen / cm2. Cellen groeien tot confluentie (P2-MSC's). Oogst cellen door protease spijsvertering zoals beschreven van stap 4,3 naar stap 4.5 en ga verder met de karakterisering zoals beschreven in paragraaf 3. LET OP: Een percentage van CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg cellen lager is dan 95% zou slechts een gedeeltelijke differentiatie aan te geven en om een aanvullend cultuur passage. Plaat P2-MSC's bij 2 x 10 4 / cm 2 in zes goed TC-behandelde platen en te groeien tot confluentie in MSC-RS medium. Mark twee putten als "No Diff" en vernieuwen MSC-RS medium. Mark twee goeds als "Osteo" en medium te vervangen door 200 ul / cm2 standaard osteogene medium, speciaal ontworpen voor MSC differentiatie. Mark twee putten als "Adipo" en medium te vervangen door 200 ul / cm2 standaard adipogenic medium, speciaal ontworpen voor MSC differentiatie. Handhaaf kweken bij 37 ° C in 5% CO 2 door het veranderen van het gehele medium elke 48 uur. LET OP: Het wordt sterk aangeraden om standaard in de handel verkrijgbare differentiëren media te gebruiken voor de test reproduceerbaarheid. Na 2/3 weken onder differentiërende omstandigheden, kalkafzettingen verschijnen in osteogene geïnduceerde kweken, terwijl intracellulaire vetdruppels accumulatie is duidelijk in adipogenic geïnduceerde cellen. Aspireren en gooi kweekmedium daarna wassen met D-PBS. Bevestig de kweken door toevoegen van 1 ml 4% (w / v) paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voor het verwijderen van fixatief toevoegen D-PBS, incubeer gedurende 2 minuten en giet. Herhaal het wassentwee keer. Vlekken op een "No Diff" samen met de twee "Osteo" gemarkeerd putten in hydroxyapatiet specifieke tl-oplossing en een "No Diff" samen met de twee "Adipo" putten in 200 nm Nile Rode oplossing gemarkeerd. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur 11,12. Verwijder vlekken oplossingen en wassen in D-PBS twee keer. Verwijder D-PBS, voeg D-PBS gesupplementeerd met 50% (v / v) glycerol en ga naar grafische 7 9 10. 5. MPC Sferoïde Sprouting Assay 3D sferoïden produceren lag 20 ul druppels vers geïsoleerde MPC suspensie (1,5 x 10 4 cellen / drop) op het binnenoppervlak van een petrischaal deksel. LET OP: Als handling druppels zou kunnen leiden tot hun breuk, is het zeer aan te bevelen om ze lag in overmaat. Gebruik het deksel voorzichtig naar een petrischaal met D-PBS om te voorkomen dat hangende druppels verdampen recapituleren. Incubeer bij 37 ° C in 5% CO 2's nachts om cellen te aggregeren in 3D bolletjes. Stel een dikke gel van muizen extracellulaire matrix (ECM) eiwitten door toevoeging van 300 ul aliquots van standaard ECM eiwitten in een voorgekoelde 24 putjes kweekplaat, en incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. tip voorzichtig over de petrischaal deksel en voorzichtig pak de bolletjes met behulp van een steriele Pasteur pipet. Leg sferoïden op de ECM eiwitgel, voeg 700 ul aliquots van standaard VEGF-rijke endotheliale celgroei medium en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2. Na 24 uur en 7 dagen cultuur, nemen foto's van de 3D kweken bij 4X vergrotingsfactor. Evalueer ontspruit uit bolletjes toepassing van beeldanalyse software door het meten van de radiale afstand tussen de laatste invasie cel en de bolvormige rand. Herhaal maatregelen langs ten minste 20 verschillende richtingen. De gemiddelde afstand wordt beschouwd als positief als 50 urn of meer.