Isolare le cellule progenitrici Mesangiogenic (PPM) da midollo osseo umano

NOTA: dopo il consenso scritto, campioni HBM sono stati ottenuti durante l'intervento chirurgico ortopedico per protesi d'anca. Subito dopo femorale osteotomia collo e prima femorale alesatura una siringa da 20 ml contenente 500 UI di eparina, è stato utilizzato per aspirare BM fresco. Il protocollo è da considerarsi ampiamente applicabile a qualsiasi fonte BM. 1. Isolamento dell'osso umano cellule del midollo mononucleate (HBM-MNC) Diluire 5 – 10 ml di BM fresco a 50 ml, l'applicazione di una soluzione salina tamponata con fosfato Dulbecco (D-PBS) e mescolare per inversione. Altrettanto distribuire 25 ml in due nuove provette da 50 ml coniche, aggiungere 25 ml di D-PBS in ogni provetta e miscelare per inversione. Lasciare le provette riposare per 10 min a temperatura ambiente, per la separazione di frammenti ossei minerali e grasso dalla soluzione. Rimuovere con attenzione il grasso galleggiante con una pipetta e filtro sospensione cellulare Pasteur sterile attraverso 70 micron filtri senza disturbare il frammento pellet minerale ossea. <li> Imposta quattro 50 ml provette con 15 ml di terreno per discontinua centrifugazione in gradiente di densità (1.077 g / ml). Assicurarsi che questo mezzo è a temperatura ambiente. Delicatamente lay 20 – 25 ml di diluito BM sulla parte superiore del gradiente di densità media. Eseguire questa operazione con attenzione, lasciando gocciolare sospensione cellulare sulle pareti dei tubi per evitare strati di miscelazione. Effettuare gradiente di densità centrifugazione a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente con freno disattivato. Raccogliere l'anello biancastro di cellule situate tra le due fasi usando una pipetta Pasteur sterile e trasferirlo in una nuova provetta 50 ml. Lavare le cellule con mezzo di coltura fresco: rosso fenolo-libero, basso livello di glucosio (1.000 mg / l) Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) pool di tipo AB siero umano (PhABS), 2 mM L-glutammina e antibiotici (/ 10% PhABS DMEM). Centrifugare a 400 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere pellet in 5 – 10 ml di DMEM fresco / 10% PhABS. Procedere alla conta delle cellule.Determinare il numero di globuli bianchi da 1: 1 diluizione trypan. Applicare questo al emocitometro, e osservare al microscopio a contrasto di fase. Escludere le piccole e perfettamente arrotondati eritrociti e cellule morte blu macchiato dalla conta delle cellule. NOTA: Si raccomanda di PhABS schermo lotti per le loro prestazioni nel recupero MPC. PhABS da fonti USA hanno dato i migliori risultati, mentre la maggior parte sieri di diversa origine ha provocato culture MPC con percentuali più elevate di cellule MSC-like. 2. Isolamento di PPM da HBM-multinazionali Impostare idrofobiche T-75 beute da 15 ml di DMEM fresco / 10% PhABS e lasciate pH e la temperatura si equilibrano pre-incubazione a 37 ° C in 5% CO 2 per 30 min. Seed 4-6 x 10 7 HBM-multinazionali per pallone e incubare a 37 ° C in 5% di CO 2 per 48 ore. Aspirare ed eliminare le cellule medie e non aderenti da fiaschi. Aggiungere 15 ml di fresca DMEM / 10% PhABS e incubare a 37 ° Cnel 5% di CO 2. Mantenere le culture per 6 – 8 giorni, il cambio medio ogni 48 ore. Facoltativo: per aumentare la resa MPC, le cellule non aderenti da 2.3 potrebbero essere ri-placcato in un nuovo pallone di coltura e mantenute come descritto per le colture primarie. Aspirare e scartare media da fiaschi, lavare con DMEM fresco e aggiungere 2 ml di animale proteasi distacco soluzione. Incubare a 37 ° C per 5 – 15 minuti (evitare di incubazione prolungata). Aggiungere 10 ml di fresca DMEM / 10% PhABS, aspirare la sospensione cellulare e centrifugare a 400 xg per 5 min Aspirare e scartare il surnatante e risospendere pellet in 1 – 2 ml di DMEM fresco / 10% PhABS. Procedere alla conta delle cellule come descritto al punto 1.10. NOTA: non utilizzare tripsina / EDTA come distacco reagente. PPM sono tripsina resistente. proiezione morfologica delle culture, prima raccolta di cellule, è consigliabile per valutare la presenza di cellule MSC-like fusiformi. In caso notevole quantità di cellule MSC-simili sono detected, aumentare la purezza del prodotto cellulare rimuovendo selettivamente le cellule contaminati. Per fare ciò, tripsina digestione può essere effettuata prima MPC raccolta, aggiungendo 2 ml di tripsina / EDTA 0,05% per 2 min. culture lavare due volte con 5 ml di DMEM / 10% PhABS, quindi procedere alla proteasi trattamento come sopra. 3. Caratterizzazione delle cellule Citometria a flusso Impostare campioni duplicati di 10 5 cellule appena staccati in soluzione di lavaggio: D-PBS integrato con 0,5% (v / v) di siero albumina bovina (BSA) e 0,02% (w / v) di sodio azide. Centrifugare a 400 xg per 5 min. ATTENZIONE: sodio azide è tossica. Risospendere pellet in 200 ml di soluzione di lavaggio e aggiungere anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 e gli anticorpi anti-CD31 coniugati con coloranti fluorescenti ( "test"); in parallelo istituito controlli isotipo ( "CTRL"). NOTA: Le quantità di colorazione anticorpi dovrebbero essere determinati per titolazione o According le istruzioni del produttore. Incubare i campioni a 4 ° C per 30 min. Centrifugare a 400 xg per 5 min. Risospendere le cellule in 500 ml di soluzione di lavaggio e di acquisire almeno 5 x 10 4 eventi in flusso multicolore citometro 7 9 10. Analizzare i risultati di dot-trame e usare "CTRL" eventi registrati per impostare quadranti. NOTA: Al fine di definire la cultura come la cultura MPC la percentuale di CD73 neg CD90 neg CD45 + cellule CD31 + dovrebbe essere oltre il 95%. Per alcune applicazioni specifiche, cioè, analisi di espressione genica, il recupero cut-off deve essere aumentata a 97 – 98%. il rilevamento e l'analisi Nestin organizzazione F-actina Piastra PPM di fresco isolato su slitte camera di cultura (20.000 / cm 2). Consentono alle cellule di aderire mediante incubazione overnight a 37 ° C in 5% CO 2. Lavare le cellule in soluzione di lavaggio e fix a 4% (w / v) para-formaldeide a temperatura ambiente per 15 min. Per rimuovere fissativo aggiungere soluzione di lavaggio, incubare per 2 minuti e versare. Ripetere l'operazione di lavaggio due volte. Permeabilize cellule in D-PBS integrato con 0,05% (v / v) Triton X-100 per 15 minuti a RT. Arrestare reazione da proteine ​​enhancer connessione di segnale (30 min a RT) o soluzione di saturazione standard (D-PBS integrato con 3% (w / v) BSA). Rimuovere potenziatore di segnale / soluzione bloccante. Aggiungere 7 pg / ml (w / v) di anticorpo primario nestin anti-umana e incubare a 4 ° C per una notte in una camera umidificata. In parallelo, usare gli anticorpi controllo isotipico per valutare segnali di fluorescenza non specifici. Lavare i vetrini con l'aggiunta di D-PBS, lasciare per 2 minuti e versare. Ripetere due volte. Aggiungere 2 ug / ml (w / v) di colorante fluorescente anticorpo secondario coniugato e incubare a 4 ° C per 1 ora al buio. Lavare i vetrini come sopra. Aggiungi falloidina fluorescente (5 UI / ml), lasciare a temperatura ambiente per 30 min al buio e lavare 3 volte in D-PBS. Rimuovere le pareti della camera e montare le diapositive in mezzo di montaggio acquoso integrato con antifade reagente e 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per il rilevamento di nuclei. Procedere al di imaging 7 9 10. 4. Mesengenic Differenziazione di PPM Piastra 2 x 10 4 / cm 2 PPM appena isolate in fiasche di coltura T75 TC-trattati e lasciare che le cellule aderiscono durante la notte in DMEM / 10% PhABS a 37 ° C in 5% di CO 2. Sostituire DMEM / 10% PhABS con medie standard ridotta siero, circa 200 ml / cm 2, progettato per l'espansione delle cellule mesenchimali stromali (media MSC-RS). Crescere le cellule a confluenza (P1-MSC), tipicamente da 7 a 10 giorni dalla induzione. Refresh media ogni 2 giorni. Aspirare e scartare media da fiaschi, lavare con media MSC-RS fresca e aggiungere 2 ml di animale proteasi distacco soluzione. Incubare a 3776; C per 5 – 15 minuti (evitare di incubazione prolungata). Aggiungere 10 ml di terreno MSC-RS fresco, aspirare la sospensione cellulare e centrifugare a 400 xg per 5 min Aspirare il surnatante e risospendere pellet in 1 – 2 ml di mezzo MSC-RS fresco. Procedere alla conta delle cellule come descritto al punto 1.10 Procedere alla sub-cultura loro da semina 3-5 x 10 3 cellule / cm 2. Crescere le cellule a confluenza (P2-MSC). Celle di raccolta di proteasi digestione come descritto dal punto 4.3 al punto 4.5 e procedere alla caratterizzazione come descritto nel paragrafo 3. NOTA: Una percentuale di cellule CD31 neg neg CD73 + CD90 + CD45 inferiore al 95% indicherebbe solo parziale differenziazione e richiedono un ulteriore passaggio cultura. Piastra P2-MSC a 2 x 10 4 / cm 2 in sei piatti ben TC-trattati e crescere fino a confluenza in media MSC-RS. Mark due pozzi come "No Diff" e rinfrescare medio MSC-RS. Mark due bens come "Osteo" e sostituire media con 200 pl / cm 2 di media osteogenico norma, specificamente progettato per la differenziazione MSC. Mark due pozzi come "Adipo" e sostituire media con 200 pl / cm 2 di media adipogenico norma, specificamente progettato per la differenziazione MSC. Mantenere le culture a 37 ° C in 5% di CO 2 modificando tutto il supporto ogni 48 ore. NOTA: Si consiglia di utilizzare supporti di differenziazione disponibili in commercio standard, per la prova di riproducibilità. Dopo 2/3 settimane in condizioni di differenziazione, depositi di calcio appaiono in osteogeniche indotta culture, mentre intracellulari gocce lipidiche accumulo è evidente nelle cellule adipogenici indotta. Aspirare e scartare terreni di coltura poi lavare con D-PBS. Fissare le culture aggiungendo 1 ml di 4% (w / v) para-formaldeide per 15 min a temperatura ambiente. Per rimuovere fissativo aggiungere D-PBS, incubare per 2 minuti e versare. Ripetere il lavaggiodue volte. Macchia un "No Diff" insieme con i due "Osteo" segnato pozzi in soluzione fluorescente specifica idrossiapatite e uno "No Diff" insieme con i due "Adipo" segnato pozzi a 200 nM soluzione Nile Red. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente 11,12. Rimuovere la colorazione soluzioni e lavare in D-PBS due volte. Rimuovere D-PBS, aggiungere D-PBS integrato con il 50% (v / v) glicerina e procedere all'imaging 7 9 10. 5. MPC Spheroid Cavolo Assay Per produrre sferoidi 3D, lay 20 gocce microlitri di sospensione MPC fresco isolato (1,5 x 10 4 cellule / drop) sulla superficie interna di un coperchio piatto Petri. NOTA: Come gocce di gestione potrebbe portare alla loro rottura, è altamente raccomandabile per disporle in eccesso. usare con cautela il coperchio per ricapitolare una capsula di Petri contenente D-PBS per evitare appeso gocce evaporazione. Incubare a 37 ° C in 5% di CO 2durante la notte per consentire alle cellule di aggregare in sferoidi 3D. Impostare una spessa gel di proteine ​​murine matrice extracellulare (ECM) aggiungendo 300 microlitri aliquote di proteine ​​ECM standard, in una piastra pre-refrigerato coltura da 24 pozzetti e incubare a 37 ° C per 30 min. facendo attenzione sopra il coperchio piastra di Petri e delicatamente raccogliere i sferoidi utilizzando una pipetta Pasteur sterile. Posare sferoidi sul gel di proteine ​​ECM, aggiungere 700 microlitri aliquote del mezzo di crescita delle cellule endoteliali ricchi di VEGF standard ed incubare a 37 ° C in 5% di CO 2. Dopo 24 ore e a 7 giorni di coltura, scattare foto delle culture 3D 4x potere di ingrandimento. Valutare spuntano da sferoidi applicano immagine software di analisi misurando la distanza radiale tra ultima cella che invade e il bordo sferoide. misure ripetute lungo almeno 20 diverse direzioni. Distanza media è considerato come positivo quando il 50 micron o sopra.