Разделительные Mesangiogenic клетки-предшественники (ПДК) из костного мозга человека

ПРИМЕЧАНИЕ: После письменного согласия образцы НВМ были получены при ортопедической хирургии для замены тазобедренного сустава. Сразу же после того, как бедренной остеотомии шеи и перед бедренных рассверливание 20 мл шприц, содержащий 500 UI гепарина, был использован для аспирата свежий BM. Протокол следует рассматривать широко применимо к любому источнику БМ. 1. Выделение костного мозга человека мононуклеарных клеток (НВМ-МНК) Разведите 5 – 10 мл свежей БМ до 50 мл, применяя фосфатный буферный солевой раствор Дульбекко (D-PBS) и перемешать с помощью инверсии. В равной степени распределить 25 мл в двух новых 50 мл конические пробирки, добавляют 25 мл D-PBS в каждую пробирку и перемешать с помощью инверсии. Дайте пробирки стоять в течение 10 мин при комнатной температуре, для разделения минеральных фрагментов костей и жира из раствора. Осторожно удалите плавающий жир с помощью стерильной пипетки Пастера и фильтра клеточной суспензии через 70 мкм-фильтры, не нарушая фрагмента гранул минеральной костной массы. <Li> Установить четыре 50 мл пробирки с 15 мл среды для прерывистого центрифугирования в градиенте плотности (1,077 г / мл). Убедитесь в том, что эта среда находится при комнатной температуре. Осторожно положите 20 – 25 мл разбавленного БМ на вершине градиента плотности среды. Выполните эту операцию осторожно, позволяя клеточной суспензии струйкой на стенках трубки для предотвращения смешивания слоев. Проводят центрифугирования в градиенте плотности при 400 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре с тормозом отключены. Соберите беловатый кольцо клеток, расположенных между двумя фазами с помощью стерильной пипетки Пастера и передать его в свежую 50 мл пробирку. Промыть клетки свежей культуральной средой: фенолового красного, низкий уровень глюкозы (1000 мг / л) Игла в модификации Дульбекко (DMEM), 10% (об / об) консервированной человеческой типа сыворотки АВ (PhABS), 2 мМ L-глутамина и антибиотики (DMEM / 10% PhABS). Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин. Отберите супернатант и повторно приостанавливать осадок в 5 – 10 мл свежей DMEM / 10% PhABS. Перейдем к количеству клеток.Определить количество белых кровяных клеток в соотношении 1: 1 разбавление в трипановым. Применить это к гемоцитомер, и наблюдать под фазово-контрастным микроскопом. Исключить маленькие и совершенно округлые эритроциты и синих пятнах мертвые клетки из числа клеток. Примечание: Настоятельно рекомендуется экран PhABS партий для их выполнения в MPC восстановления. PhABS из источников на территории США дали лучшие результаты в то время как большинство сывороток различного происхождения привело к MPC культур с большей долей MSC-подобных клеток. 2. Выделение из MPCs HBM-МНК Установить гидрофобные Т-75 колб с 15 мл свежей DMEM / 10% PhABS и пусть рН и температуры уравновешиваться путем предварительной инкубации при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 30 мин. Семенной 4 – 6 х 10 7 НВМ-МНК на колбу и инкубируют при температуре 37 ° С в 5% CO 2 в течение 48 часов. Отберите и выбросьте среднего и не прилипшие клетки из колб. Добавьте 15 мл свежей DMEM / 10% PhABS и инкубировать при 37 ° Cв 5% CO 2. Поддержание культуры в течение 6 – 8 дней, изменение среды каждые 48 ч. Необязательно: Чтобы увеличить MPC выход, не прилипшие клетки от 2,3 может быть повторно высевали в новую культуру колбу и поддерживали, как описано для первичных культур. Отберите и выбросьте среды из колбы, промывают свежей DMEM и добавьте 2 мл свободной протеазы животного отсоединении раствора. Инкубируют при 37 ° С в течение 5 – 15 мин (во избежание длительной инкубации). Добавляют 10 мл свежей DMEM / 10% PhABS, аспирация суспензии клеток и центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин Отберите и отбросить супернатант и повторно приостанавливать осадок в 1 – 2 мл свежей среды DMEM / 10% PhABS. Перейдем к количеству клеток, как описано в шаге 1.10. ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте трипсин / ЭДТА в качестве отсоединении реагента. ПДКп являются трипсин устойчивостью. Морфологические скрининг культур, до сбора клеток, настоятельно рекомендуется, чтобы оценить наличие веретенообразных MSC-подобных клеток. В случае значительного количества МСК-подобных клеток detected, повысить чистоту продукта клеток путем селективного удаления загрязненных клеток. Для этого, трипсин-переваривание может быть осуществлено до сбора MPC, путем добавления 2 мл трипсина / ЭДТА 0,05% в течение 2 мин. Wash культур дважды с 5 мл DMEM / 10% PhABS, а затем перейти к протеазному обработку, как описано выше. 3. Характеристика Cell Проточной цитометрии Настройка дублирующие образцы 10 5 свеже отдельных клеток в моющем растворе D-PBS , дополненной 0,5% (объем / объем) бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,02% (вес / объем) азида натрия. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин. ВНИМАНИЕ: азид натрия является токсичным. Повторное приостановить гранул в 200 мкл промывочного раствора и добавить анти-CD90, анти-CD45, анти-CD73 и анти-CD31 антитела, конъюгированные с флуоресцентными красителями ( "Test"); параллельно настроить изотипа управления ( "Ctrl"). Примечание: Суммы окрашивания антител должны быть определены путем титрования или Accorдинь с инструкциями производителя. Инкубируйте образцы при температуре 4 ° С в течение 30 мин. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин. Повторное приостановить клеток в 500 мкл промывочного раствора и получают по меньшей мере 5 × 10 4 событий на потоке многоцветной цитометра 7 9 10. Анализ результатов по дот-графиков и использовать "Ctrl" записанные события, чтобы установить квадранта. Примечание: Для того , чтобы определить культуру как MPC культуры процент CD73 нег CD90 нег CD45 + CD31 + клеток должно быть более 95%. Для некоторых конкретных применений, например, анализ экспрессии генов, восстановление отсечка должна быть увеличена до 97 – 98%. Nestin обнаружение и анализ F-актин организация Пластинчатые свежевыделенные ПДКп на культуре камеры горками (20000 / см 2). Разрешить клетки придерживаться путем инкубации в течение ночи при 37 ° С в 5% CO 2. Вымойте клеток в моющем растворе и Ф.И.х в 4% (вес / объем) пара-формальдегидом при комнатной температуре в течение 15 мин. Чтобы удалить закрепляющий добавить моющий раствор, инкубировать в течение 2 мин и разлить. Повторите промывку дважды. Проницаемыми клетки в D-PBS с добавлением 0,05% (об / об) Тритона X-100 в течение 15 мин при комнатной температуре. Остановить реакцию белка свободного энхансер сигнала (30 мин при комнатной температуре) или стандартным блокирующим раствором (D-PBS с добавлением 3% (вес / объем) БСА). Удалить сигнал энхансер / блокирующего раствора. Добавить 7 мкг / мл (вес / об) античеловеческой нестина первичного антитела и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи во влажной камере. Параллельно с этим, использовать изотипные контрольные антитела оценить не специфические сигналы флуоресценции. Вымойте слайдов путем добавления D-PBS, оставьте в течение 2 мин и разлить. Повторите дважды. Добавить 2 мкг / мл (вес / объем) флуоресцентных красителей конъюгированного вторичного антитела и инкубируют при 4 ° С в течение 1 ч в темноте. Вымойте слайды, как указано выше. Добавить флуоресцентный фаллоидином (5 МЕ / мл), оставьте при комнатной температуре в течение 30 мв в темное время суток и промыть 3 раза в D-PBS. Удалите стенки камеры и крепления слайдов в водной среде, дополненной монтажном с antifade реагентом и 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для обнаружения ядер. Перейдите к визуализации 7 9 10. 4. Mesengenic Дифференциация MPCs Пластина 2 х 10 4 / см 2 свежевыделенные ПДКп в ТК-обработанных культуральных флаконах Т75 и пусть клетки прилипать в течение ночи в среде DMEM / 10% PhABS при 37 ° С в 5% CO 2. Заменить DMEM / 10% PhABS со стандартным снижением сыворотки среды, около 200 мкл / см 2, предназначенный для расширения мезенхимальных стромальных клеток (MSC-RS среды). Рост клеток до слияния (P1-MSCs), как правило, от 7 до 10 дней от индукции. Обновить средний каждые 2 дня. Отберите и выбросьте среды из колбы, промывают свежей средой MSC-RS и добавляют 2 мл свободной протеазы животного отсоединении раствора. Инкубировать при температуре 3776 ° С в течение 5 – 15 мин (во избежание длительной инкубации). Добавьте 10 мл свежей среды MSC-RS, аспирация суспензии клеток и центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин Отберите супернатант и повторно приостанавливать осадок в 1 – 2 мл свежей среды MSC-RS. Перейдем к количеству клеток, как описано в шаге 1.10 Перейдите к субкультуре их посевом 3 – 5 х 10 3 клеток / см 2. Рост клеток до слияния (P2-MSCs). Урожай клеток путем протеазы пищеварения, как описано со стадии 4.3 к шагу 4.5 и перейти к характеристике, как описано в разделе 3. Примечание: Процент CD73 + CD90 + CD45 нег CD31 нег клеток ниже 95% будет означать лишь частичную дифференциацию и требуют дальнейшего культивирования проход. Пластина P2-MSCs при 2 х 10 4 / см 2 в шести хорошо TC обработанных пластин и расти до слияния в МСЦ-RS среде. Марк две скважины, как "No Diff" и обновить MSC-RS среды. Марк два хорошоs как "Osteo" и заменить среду с 200 мкл / см 2 стандартного остеогенной среды, специально разработанной для MSC дифференциации. Марк две скважины , как "ADIPO" и заменить среду с 200 мкл / см 2 стандартного адипогенной среды, специально разработанной для MSC дифференциации. Поддержание культуры при 37 ° С в 5% СО 2 при условии изменения всей массовой информации каждые 48 ч. Примечание: Настоятельно рекомендуется использовать стандартные коммерчески доступные дифференцирующие носители для воспроизводимости результатов испытания. Через 2/3 недель условиях дифференцировки, отложения кальция появляются в остеогенных индуцированных культур, в то время как накопление внутриклеточные липидные капли проявляется в адипогенных индуцированных клеток. Отберите и выбросьте питательные среды затем промыть D-PBS. Закрепить культур путем добавления 1 мл 4% (вес / объем) пара-формальдегидом в течение 15 мин при комнатной температуре. Чтобы удалить закрепляющий добавить D-PBS, инкубировать в течение 2 мин и разлить. Повторите промываниедважды. Пятно один "No Diff" вместе с двумя "костно" отмечены скважины в гидроксиапатита конкретного флуоресцентного раствора и один "No Diff" вместе с двумя "Adipo" отмечены скважины в 200 нМ нильский красный раствор. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре 11,12. Удалить окрашивания растворов и мыть в D-PBS дважды. Удалить D-PBS, добавить D-PBS с добавлением 50% (об / об) глицерине и перейти к визуализации 7 9 10. 5. MPC Сфероид Проращивание Анализ Для создания 3D сфероидов, лежали 20 мкл капель свежевыделенными MPC суспензии (1,5 × 10 4 клеток / капли) на внутренней поверхности крышки тарелки Петри. Примечание: В качестве обработки капель может привести к их разрыву, то настоятельно рекомендуется укладывать их в избытке. Осторожно использовать крышку, чтобы резюмировать чашку Петри, содержащую D-PBS, чтобы предотвратить испарение висячей капли. Инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2ночь, чтобы клетки агрегировать в 3D сфероидов. Установить густой гель мышиных внеклеточного матрикса (ECM) белков путем добавления 300 мкл аликвоты стандартных белков ЕСМ в предварительно охлажденный 24-луночный планшет для культивирования, и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Тщательно опрокинуться блюдо крышкой Петри и осторожно подобрать сфероиды с помощью стерильной пипетки Пастера. Lay сфероиды на гель белка ЕСМ, добавляют 700 мкл аликвоты стандартного VEGF-обогащенной среде роста эндотелиальных клеток и инкубируют при температуре 37 ° С в 5% CO 2. Через 24 часа и через 7 дней культивирования, сфотографировать 3D культур при увеличении мощности 4X. Оценка отростков сфероидов, претендующих программного обеспечения для анализа изображений путем измерения радиального расстояния между последней ячейкой и вторгающегося сфероида края. Повторные меры вдоль, по меньшей мере, 20 различных направлений. Среднее расстояние считается положительным, когда 50 мкм или более.