Isoler cellules progénitrices Mesangiogenic (PPM) de Human Bone Marrow

NOTE: Après consentement écrit, des échantillons HBM ont été obtenus au cours de la chirurgie orthopédique pour le remplacement de la hanche. Immédiatement après l'ostéotomie du col du fémur et du fémur avant aléser une seringue de 20 ml contenant 500 UI d'héparine, a été utilisée pour aspirer le BM frais. Le protocole doit être considéré comme largement applicable à toute source BM. 1. Isolement de l'os humain de cellules de moelle osseuse mononucléaires (HBM-PTM) Diluer 5 – 10 ml de BM frais de 50 ml, en appliquant la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (D-PBS) et on mélange par inversion. répartir également 25 ml dans deux nouveaux tubes coniques de 50 ml, ajouter 25 ml de D-PBS à chaque tube et mélanger par retournement. Laisser les tubes reposer pendant 10 min à température ambiante, pour la séparation de fragments d'os minéraux et de matières grasses de la solution. Retirez délicatement la graisse flottante avec une pipette et filtre Pasteur suspension cellulaire stérile à travers 70 um filtres sans perturber l'os minéral fragment pellet. <li> Ensemble de quatre tubes de 50 ml avec 15 ml de milieu à gradient discontinu de densité de centrifugation (1,077 g / ml). Assurez-vous que ce milieu est à la température ambiante. Déposer délicatement 20 – 25 ml de dilution BM au-dessus du milieu de gradient de densité. Effectuez cette opération avec soin, laissant suspension cellulaire filet sur les parois du tube pour empêcher les couches de mélange. Effectuer un gradient de densité centrifugation à 400 xg pendant 30 min à température ambiante avec frein désactivé. Récupérer la bague blanchâtre de cellules situées entre les deux phases à l'aide d'une pipette Pasteur stérile et le transférer dans un nouveau tube de 50 ml. Laver les cellules avec un milieu de culture frais: rouge de phénol libre, faible taux de glucose (1,000 mg / l) milieu de Eagle modifié Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) mise en commun de type AB sérum humain (PhABS), 2 mM de L-glutamine et des antibiotiques (DMEM / 10% PhABS). Centrifuger à 400 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 à 10 ml de DMEM frais / 10% PhABS. Passez à la numération cellulaire.Déterminer le nombre de globules blancs par dilution 1: 1 en trypan. Appliquer à l'hémocytomètre, et observer sous microscope à contraste de phase. Exclure les petites et parfaitement arrondis érythrocytes et les cellules mortes colorées en bleu de la numération cellulaire. NOTE: Il est fortement recommandé de PhABS écran lots pour leur performance dans la récupération MPC. PhABS provenant de sources USA ont donné de meilleurs résultats alors que la plupart des sérums d'origine différente a donné lieu à des cultures MPC avec des pourcentages plus élevés de cellules MSC-like. 2. Isolement des PPM de HBM-PTM Fixer hydrophobes flacons T-75 avec 15 ml de DMEM frais / 10% PhABS et laisser le pH et la température équilibrent par une pré-incubation à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 30 min. Seed 4-6 x 10 7 HBM-MNC par flacon et incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant 48 heures. Aspirer et jeter les cellules moyennes et non-adhérentes des flacons. Ajouter 15 ml de DMEM frais / 10% PhABS et incuber à 37 ° Cà 5% de CO 2. Maintenir les cultures pour 6 – 8 jours, le changement moyen toutes les 48 heures. EN OPTION: Pour augmenter le rendement MPC, les cellules non-adhérentes de 2.3 pourraient être ré-étalées dans un nouveau flacon de culture et maintenus comme décrit pour les cultures primaires. Aspirer et jeter milieu des flacons, laver avec du DMEM frais et ajouter 2 ml d'animaux protéase libre solution détachant. Incuber à 37 ° C pendant 5 – 15 min (éviter une incubation prolongée). Ajouter 10 ml de DMEM frais / 10% PhABS, aspirer la suspension cellulaire et centrifuger à 400 g pendant 5 min Aspirer et éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 – 2 ml de DMEM frais / 10% PhABS. Passez à nombre de cellules comme décrit à l'étape 1.10. NOTE: Ne pas utiliser de trypsine / EDTA comme détachant réactif. PPMs sont trypsine résistants. le dépistage morphologique des cultures, avant la récolte des cellules, est fortement recommandée afin d'évaluer la présence de cellules MSC-like en forme de fuseau. En cas quantité considérable de cellules MSC-like sont detected, d'augmenter la pureté du produit cellulaire en éliminant sélectivement les cellules contaminées. Pour ce faire, digestion par la trypsine peut être réalisée avant la récolte MPC, en ajoutant 2 ml de trypsine / EDTA 0,05% pendant 2 min. cultures Laver deux fois avec 5 ml de DMEM / 10% PhABS, puis procéder à la protéase traitement comme ci-dessus. 3. Cellule Caractérisation La cytométrie en flux Mettre en place des échantillons en double de 10 5 cellules fraîchement isolées dans la solution de lavage: D-PBS additionné de 0,5% (v / v) de sérum – albumine bovine (BSA) et 0,02% (p / v) d' azoture de sodium. Centrifuger à 400 g pendant 5 min. ATTENTION: L' azoture de sodium est toxique. Remettre en suspension des pastilles dans 200 ul de solution de lavage et ajouter de l'anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 et anti-CD31 des anticorps conjugués avec des colorants fluorescents ( «TEST»); en parallèle mis en place des contrôles isotypiques ( "CTRL"). NOTE: Les quantités de coloration des anticorps doivent être déterminés par titrage ou according aux instructions du fabricant. Incuber les échantillons à 4 ° C pendant 30 min. Centrifuger à 400 g pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans 500 ul de solution de lavage et l' acquisition d' au moins 5 x 10 4 sur le flux des événements multicolore cytomètre 7 9 10. Analyser les résultats par point-parcelles et utiliser "CTRL" événements enregistrés pour définir quadrants. NOTE: Afin de définir la culture comme la culture MPC le pourcentage de CD73 CD90 neg neg CD45 + CD31 + cellules devrait être supérieure à 95%. Pour certaines applications spécifiques, par exemple une analyse d'expression génique, la reprise de coupure doit être augmenté à 97-98%. détection Nestin et F-actine analyse de l'organisation Plate PPMs fraîchement isolés sur des lames de la chambre de culture (20 000 / cm 2). Permettre aux cellules d'adhérer par une incubation pendant une nuit à 37 ° C dans 5% de CO2. Laver les cellules dans une solution de lavage et de fix dans 4% (p / v) de para-formaldéhyde à la température ambiante pendant 15 min. Pour supprimer fixateur ajouter la solution de lavage, incuber pendant 2 min et versez. Répéter deux fois le lavage. Perméabiliser les cellules dans D-PBS additionné de 0,05% (v / v) de Triton X-100 pendant 15 min à température ambiante. Arrêter la réaction en protéine libre amplificateur de signal (30 min à température ambiante) ou d'une solution de blocage standard (D-PBS additionné de 3% (p / v) de BSA). Retirer le signal activateur / solution de blocage. Ajouter 7 pg / ml (p / v) de l'anticorps primaire anti-humain de la nestine et incuber à 4 ° C pendant une nuit dans une chambre humidifiée. En parallèle, utiliser des anticorps de contrôle isotypiques pour évaluer les signaux de fluorescence non spécifiques. Laver les lames en ajoutant D-PBS, laisser pendant 2 minutes et verser. Répéter deux fois. Ajouter 2 pg / ml (p / v) de colorant fluorescent, un anticorps secondaire conjugué et on incube à 4 ° C pendant 1 heure dans l'obscurité. Laver les lames comme ci-dessus. Ajouter phalloïdine fluorescente (5 UI / ml), laisser à température ambiante pendant 30 mdans dans l'obscurité et laver 3 fois dans D-PBS. Retirer les parois de la chambre et monter les diapositives dans un milieu de montage aqueux additionné de antifade réactif et 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour la détection des noyaux. Passez à l' imagerie 7 9 10. 4. Mesengenic Différenciation des PPM Planche 2 x 10 4 / cm 2 PPMs fraîchement isolés dans TC-traités T75 flacons de culture et laisser les cellules adhérer pendant une nuit dans DMEM / 10% PhABS à 37 ° C dans 5% de CO 2. Remplacer le milieu DMEM / 10% PhABS avec un milieu standard de sérum réduit, d' environ 200 pl / cm 2, conçu pour l' expansion des cellules mésenchymateuses du stroma (milieu CSM-RS). Cultiver les cellules jusqu'à la confluence (P1-MSCs), généralement de 7 à 10 jours à compter de l'induction. Actualisez moyenne tous les 2 jours. Aspirer et jeter milieu des flacons, se laver avec du milieu MSC-RS fraîche et ajouter 2 ml d'animaux protéase libre solution détachant. Incuber à 3776; C pendant 5 – 15 min (éviter une incubation prolongée). Ajouter 10 ml de milieu MSC-RS fraîche, aspirer la suspension cellulaire et centrifuger à 400 g pendant 5 min Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 – 2 ml de milieu MSC-RS frais. Passez à nombre de cellules comme décrit à l'étape 1.10 Passez à la sous-culture par ensemencement les 3-5 x 10 3 cellules / cm 2. Cultiver les cellules jusqu'à la confluence (P2-MSCs). cellules de récolte par protease digestion comme décrit à l'étape 4.3 à l'étape 4.5 et de procéder à la caractérisation comme décrit dans la section 3. REMARQUE: Un pourcentage de CD73 + CD90 + CD45 des cellules CD31 nég nég inférieure à 95% indique que la différenciation partielle et exiger un nouveau passage en culture. Plate P2-MSCs à 2 x 10 4 / cm 2 dans six plaques et TC-traitées et de croître jusqu'à la confluence dans un milieu MSC-RS. Marquer deux puits comme "No Diff" et actualisez moyen MSC-RS. Mark deux biens comme «ostéo» et remplacer moyenne avec 200 pl / cm 2 de milieu osteogene standard, spécialement conçu pour la différenciation MSC. Marquer deux puits comme "Adipo" et remplacer moyenne avec 200 pl / cm 2 de milieu adipogénique standard, spécialement conçu pour la différenciation MSC. Maintenir les cultures à 37 ° C dans 5% de CO 2 en changeant l'ensemble des supports 48 par heure. NOTE: Il est fortement recommandé d'utiliser les médias de différenciation standards disponibles dans le commerce pour la reproductibilité du test. Après 2/3 semaines dans des conditions de différenciation, les dépôts de calcium apparaissent dans ostéogéniques induit des cultures, tandis que des gouttelettes lipidiques intracellulaires accumulation est évident dans les cellules adipogènes induite. Aspirer et jeter les milieux de culture, puis laver avec du D-PBS. Fixer les cultures en ajoutant 1 ml de 4% (p / v) de paraformaldehyde pendant 15 minutes à température ambiante. Pour supprimer fixateur ajouter D-PBS, incuber pendant 2 min et versez. Répétez le lavagedeux fois. Colorer un "No Diff" en même temps que les deux «ostéo» marqué puits dans une solution fluorescente spécifique hydroxyapatite et un "No Diff" avec les deux "Adipo" marqué puits dans 200 nM solution rouge Nil. Incuber pendant 30 min à température ambiante , 11,12. Retirer la coloration des solutions et laver dans D-PBS deux fois. Retirer du D-PBS, ajouter du D-PBS supplémenté avec 50% (v / v) de glycérine et de procéder à l' imagerie 7 9 10. 5. MPC Spheroid Germination Assay Pour produire sphéroïdes 3D, poser des gouttes de 20 pi de suspension fraîchement isolés de MPC (1,5 x 10 4 cellules / goutte) sur la surface intérieure d'un plat couvercle Petri. NOTE: Comme des gouttes de manipulation pourraient conduire à leur rupture, il est fortement recommandé de les poser en excès. utiliser avec précaution le couvercle pour récapituler une boîte de Pétri contenant du D-PBS pour empêcher la pendaison chute évaporation. Incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2la nuit pour permettre aux cellules d'agréger en sphéroïdes 3D. Définir un gel épais de protéines murines matrice extracellulaire (ECM) en ajoutant 300 uL d'aliquotes de protéines d'ECM standards dans une plaque de pré-réfrigérée culture à 24 puits et incuber à 37 ° C pendant 30 min. Basculez avec précaution sur le plat couvercle Petri et ramasser doucement les sphéroïdes à l'aide d'une pipette Pasteur stérile. Déposer sphéroïdes sur le gel de protéine d'ECM, ajouter 700 ul de parties aliquotes de milieu de croissance endothélial cellulaire VEGF riche standard et laisser incuber à 37 ° C dans 5% de CO2. Après 24 heures et à 7 jours de culture, prendre des photos des cultures 3D à 4X puissance de grossissement. Évaluer la germination de sphéroïdes appliquant un logiciel d'analyse d'image en mesurant la distance radiale entre la dernière cellule d'invasion et le bord sphéroïde. mesures répétées le long d'au moins 20 directions différentes. la distance moyenne est considéré comme positif lorsque 50 um ou plus.