Rongeur de travail Modèle de coeur pour l'étude de la performance myocardique et la consommation d'oxygène

Ce protocole est effectué en vertu d'un protocole en vigueur dans les soins des animaux et l'utilisation du comité de l'institution. 1. Préparation à l'étude Allumez le bain d'eau pour chauffer le réservoir tampon de Krebs-Henseleit (KHB) (réglé à 42 ° C). Préparer 16 litres de KHB contenant (en mM) 128 NaCl, 5,7 KCl, 1,3 MgSO4, 25 NaHCO 3, 2,7 CaCl2, 0,53 EDTA 0,54 NaCl 3 H 3 O 3 et 10,8 dextrose. 13 Les masses de substrat sont les suivantes : 27,584 g de NaCl, 1,58 g de KCl, 0,578 g de MgSO4, 8,401 g de NaHCO3, 1,47 g de CaCl2, 0,744 g d' EDTA, 0,22 g NaCl 3 H 3 O 3 et 7,208 g de dextrose. Note: ces composants peuvent être stockés dans des tubes coniques en forme de poudre pour une reconstitution au jour de l'expérimentation. Filtre 4 L d'eau déminéralisée à travers un filtre de 0,22 micron. Ajouter 3,7 L de cette eau à un 4 Lgobelet. Ajouter tous les composants à l' exception de CaCl2 dans l'eau. Dissoudre le CaCl 2 dans les 300 ml restants de l' eau en utilisant un bêcher séparé. Oxygéner la solution avec 95% O 2/5% CO 2 à 1 L / min (LPM) pendant 5 min. Cela corrige le pH à 7,40 et améliore la dissolution de CaCl 2. Ajouter le CaCl 2 au reste du KHB. Ajoutez le KHB rempli à un réservoir et circuler à travers tous les tubes pendant 30 min. Assurez-vous que le système est exempt de bulles macroscopiques. Oxygéné avec 95% O 2/5% de CO 2 à 0,5 LPM. NOTE: KHB peut être stocké pendant une nuit dans le réfrigérateur pendant plus de 1 – 2 jours ramené à température ambiante et re-filtré pour l'utilisation. Ne pas réutiliser KHB entre les expériences. Préparez 2 x 50 ml béchers propres avec KHB de glace froide et les placer dans un seau de glace près de la station de dissection. Assurez-vous que le KHB est glacée (plutôt que réfrigéré) avant ex plantation du cœur. Placer le micro-pression-volume (PV) cathéter dans une seringue de 10 ml remplie de KHB filtrée pendant 30 minutes avant le calibrage, selon les instructions du fabricant. NOTE: La température de KHB utilisé pour imprégner le cathéter PV doit être aussi proche de 37 ° C que possible. Préparer l'anesthésie et de la station de dissection pour l'animal. S'assurer isoflurane suffisante dans le réservoir. Dresser 500 U d'héparine dans une seringue de 1 ml; placer une aiguille de calibre 26 (1/2 ") sur cette seringue. Préparer un masque pour anesthésier l'animal. Régler la pression bloc de perfusion aortique à 80 mmHg et l'oreillette gauche (LA) Pression bloc de perfusion à 10 mmHg. Ouvrir la fois le bloc aortique et le bloc LA pour permettre au chaud KHB à égoutter. Lorsque vous êtes prêt à disséquer l'animal, ouvrez le bloc aortique pour permettre une perfusion lente constante de KHB out. Calibrer le cathéter de PV selon les instructions du fabricant. "> 2. Préparation des animaux et Dissection NOTE: Pour de meilleurs résultats, assurez-animal est comprise entre 300 et 500 g; nous avons constaté que le poids des animaux comprise entre 425 à 450 g est idéal pour notre système. Anesthésier l'animal dans une chambre en utilisant de l'isoflurane (1-2%) jusqu'à ce que l'animal est inconscient. Transférer l'animal vers la station de dissection et de placer le masque d'anesthésie avec de l'isoflurane et de l'oxygène sur l'animal. Effectuer pincement de l'orteil pour évaluer le niveau de sédation. Appliquer vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Injecter de l'héparine, 500 unités intrapéritonéale dans la cavité abdominale. Autoriser 10 min pour le Héparine d'être absorbé. Fixer les membres de l'animal avec du ruban adhésif pour améliorer la visualisation du thorax. Dissection du cœur. Une fois assurant qu'il n'y a pas de réponse à un pincement de l'orteil, soulever la peau loin de la cavité abdominale avec une pince, puis utiliser des ciseaux pour inciser la cavité péritonéale, suivant la courbe de til diaphragme retour à l'angle postérieur des côtes. Une fois que le diaphragme est visible, à l'aide de petits ciseaux, coupés le long de la surface antérieure de la membrane suivant la direction des coupes antérieures pour permettre l'entrée dans le thorax. Étendre chaque coupe le long de la ligne axillaire bilatérale à l'aisselle. REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées de manière efficace puisque la ventilation sera compromise lorsque le diaphragme est incisé. Rentrez la cage thoracique antérieure du processus xiphoïde en utilisant une pince. Inciser le péricarde et la plèvre. Identifier la veine cave inférieure (VCI) et de l' aorte juste au- dessus du diaphragme et se rétracter en bloc à l' aide antérieure pince émoussée. Utilisation de grands ciseaux, courbes, faire rapidement une incision dans la VCI et l'aorte, en tirant le cœur et les poumons de la poitrine en bloc. Couper l'œsophage, la trachée, les artères et les veines brachiocéphaliques céphalique pour enlever le cœur et les poumons du thorax. Exciser le tontissu micro avec ce bloc de tissu. Prenez soin de ne pas couper la partie proximale de l'aorte ascendante. immerger immédiatement le cœur et les poumons dans la glace froide KHB et passer à l'appareil de Langendorff, précédemment mis en place comme décrit à l'étape 1. 3. Aortic Cannulation Placez le complexe cœur-poumon dans un plat et d'orienter le cœur avec le thymus et des gros vaisseaux face à l'expérimentateur et la face postérieure des poumons face à la table. Séparer les deux lobes du thymus et d'identifier le décollage des artères brachiocéphaliques de l'aorte. Draper l'aorte au-dessus de la bordure de la capsule et sectionner l'aorte à l'aide de petits ciseaux environ 5 mm au-dessus de la valve aortique, juste en amont de l'envol de l'artère sous-clavière droite. NOTE: L'incision doit donner un cercle autour propre – l'aorte en coupe. Si elle est hors-angle (ie, un large ovale)ou incomplète, répéter la coupe pour obtenir le résultat souhaité. Cela facilitera l'efficacité canulation aortique. En utilisant 2 paires de pinces incurvées de chaque côté de l'aorte, l'aorte guider au-dessus de la canule aortique (qui doit être dégouline lentement avec du KHB). La valve aortique devrait rester 1 – 2 mm en dessous de la pointe de la canule. Après l'aorte cathétérisme, repositionner la pince perpendiculairement à l'aorte pour maintenir l'aorte en place. Sinon, placez une petite pince à travers l'aorte pour maintenir le complexe cœur-poumon en place, permettant à un seul expérimentateur de compléter ce modèle. Demander à un assistant passer une suture de soie 4-0 juste en dessous de la pince et une cravate en place, en boucle autour de la canule et en attachant plusieurs fois à la fois devant et derrière le cœur. Ouvrez la canule complètement pour commencer à plein débit aortique rétrograde. Observer le coeur battre vigoureusement. NOTE: Si le cœur ne commence pas à battre rapidement (~ 200 BPM) et vigoureusement, laattacher ou d'une canule peut être occlure une ou l'autre des artères coronaires. Si cela est suspecté, enlever la cravate et le repositionner à l'écart des artères coronaires. Si le cœur distend et ne bat pas, la canule peut être à travers la valve aortique. Si les fuites de l'artère coronaire (sprays KHB de la racine de l'aorte), faire avancer la canule plus proche de la valve aortique (ce phénomène peut se produire si une artère brachiocéphalique est Cathétériser à la place de l'aorte ascendante). 4. Veine pulmonaire Occlusion et préparation de l'artère pulmonaire pour Cannulation NOTE: Le but de cette étape est de créer un système auriculaire gauche fermée pour veiller à ce que tout le volume et la pression du bloc auriculaire gauche est transmis aux structures cardiaques gauches. Le non-obturer complètement les veines pulmonaires pourrait entraîner une carence en précharge et peut fausser les résultats ou créer une préparation instable de travail cardiaque. Retirez le thymus pour améliorer l'exposition des ee artère pulmonaire (PA). faire tourner manuellement la canule aortique de sorte que la face postérieure du coeur fait face à l'opérateur. Disséquer les navires menant au poumon droit. Suspendre le tissu pulmonaire droite à l'aide des pinces pour délimiter ces navires. En utilisant des pinces chirurgicales moyennes et grandes (ou suture), obturer l'artère pulmonaire droite et de la veine et des bronches avec un seul clip. Réséquer distale du poumon droit au clip. NOTE: En raison de la difficulté à disséquer l'artère pulmonaire libre, notre pratique est de boucher les veines pulmonaires pour distendre l'artère pulmonaire, ce qui rend plus facile à inciser sans blesser les structures à proximité dans un modèle de cœur battant. Répétez l'étape 4.2 sur le poumon gauche. NOTE: les pièges potentiels et la résolution de problèmes: Une fois que les deux artères pulmonaires sont occlus, l'oreillette droite seront visiblement distendre et le cœur peuvent devenir bradycardie. En effet, le ventricule droit devient sous pression. Si cela ne se produit pas, il est probable que la pulmveines coronaire ne sont pas complètement occlus, et que la précontrainte sera insuffisante pour travailler en mode cardiaque. Si le cœur ne parvient pas à maintenir le débit cardiaque après l'oreillette gauche (LA) cathétérisme et de tentative de transition vers le cœur (voir ci-dessous) de travail, envisager de placer des clips supplémentaires ou une cravate autour des souches de la veine pulmonaire pour obturer toute fuite résiduelle. Une fois que les AP sont occlus, cependant, l'étape 5 doit être effectuée immédiatement pour minimiser l'ischémie myocardique. A noter que certains chercheurs incise l'artère pulmonaire avant la ligature des veines pulmonaires afin d'éviter la pressurisation du ventricule droit. incision artérielle pulmonaire Faire tourner la canule aortique de sorte que la face antérieure du coeur fait face à l'opérateur. Identifier l'artère pulmonaire. Encore une fois, cette artère peut être distendu. Utilisation de petits ciseaux faire une incision transversale environ 3 mm au-dessus de la valve pulmonaire. NOTE: Ce sera immédiatement soulager la pression et la fréquence cardiaque peut augmenter. Êtreprovoquer cette canule est facile à déloger, cathétériser l'artère pulmonaire après cathétérisme auriculaire gauche est terminée. 5. Gauche Atrial Cannulation Tourner la canule aortique de sorte que l'oreillette gauche fait face à l'opérateur. En utilisant les petits ciseaux, faire un 2 – mm incision 3 dans la partie supérieure du corps de l'oreillette gauche, environ 3 mm au-dessus de la rainure auriculo-ventriculaire. Positionner la canule auriculaire gauche perpendiculaire au plan de la valve mitrale et pointé vers le septum auriculaire. Ouvrez la canule LA jusqu'à ce que les flux KHB. Assurez-vous que le KHB est chaud au toucher (il fait froid rapidement lorsque vous êtes assis dans tous les tubes non chemisé) afin d'éviter la dysfonction myocardique due à l'hypothermie après la transition au mode de travail. Transition à un taux de goutte à goutte pendant cathétérisme. En utilisant des pinces pour maintenir une contre-traction, insérer la canule auriculaire dans le corps de l'oreillette gauche, en prenant soin de ne pas utiliser excessive force, qui peut déchirer l'atrium. NOTE: La canule LA doit être positionné de telle sorte qu'il se trouve au milieu de l'atrium sans aucune tension sur la paroi de l'oreillette. Passez une suture 4-0 de soie autour du corps de l'oreillette gauche et faites un noeud pour créer un joint de l'oreillette autour de la canule. Veiller à ce que la face postérieure de l'oreillette gauche est inclus dans le fil de suture. Ajouter sutures supplémentaires si nécessaire. Une fois scellé, tirez la canule arrière 1 – 2 mm de sorte qu'il se trouve au milieu de l'atrium plutôt que contre le septum auriculaire. NOTE: La raison la plus courante que le cœur devient malperfused lors de la transition vers le mode de travail du cœur est que la canule LA bute contre le septum interauriculaire, qui obture entrée auriculaire gauche. Le tracé LA change souvent de démontrer une bonne vague d'onde et v lorsque la canule est en bonne position (voir la figure 2F). Ouvrez le robinet de la canule LA entièrement pour administrer la précharge complète à l'oreillette gauche. Surveiller letaux de goutte à goutte du coeur (qui provient de l'effluent coronaire). Assurez-vous que le taux d'égouttage ne change pas lorsque la canule LA est ouverte. Dans le cas contraire, retie l'oreillette autour de la canule, comme décrit à l'étape 6.4, car cela représente une fuite dans le système. 6. pulmonaire canulation de l'artère et la transition vers le mode de travail de coeur Si la mesure de la consommation d'oxygène du myocarde (ou d'autres substances dans les effluents coronaires, tels que les niveaux de drogue ou cytokines), insérer 1/32 "tube flexible dans l'incision avant dans l'artère pulmonaire. NOTE: La consommation d'oxygène est mesurée par la différence de teneur en oxygène entre perfusat auriculaire gauche et de l' effluent de l' artère pulmonaire 2. Pour la mesure continue de la consommation en oxygène du myocarde, en utilisant une électrode à oxygène en ligne pour comparer l'oreillette gauche et du sinus coronaire effluent. Recueillir l'effluent du sinus coronaire (à la fois l'artère pulmonaire et ruisselant du coeur) dans un cyl graduéinder pour la quantification chronométré du flux coronaire. Calculer la consommation d'oxygène myocardique comme décrit précédemment. 2 Transition à travailler en mode cardiaque en éteignant la pompe aortique rétrograde. REMARQUE: Lorsque cela est fait, la pression LA devient la pression de précharge et de la résistance qui a été fourni précédemment résistance à la pompe rétrograde en mode de Langendorff fournit maintenant une résistance à un débit cardiaque, la création d'une pression artérielle moyenne. Si la pression artérielle moyenne devient inférieure à ~ 80 mmHg, la cause est probablement liée à une ou l'autre précharge ou la fonction myocardique. Le problème le plus probable est la canule de l'oreillette gauche, qui doit être ajustée après le redémarrage de la pompe rétrograde. 7. L'insertion du cathéter de volume Pression ventriculaire gauche NOTE: Le cathéter de PV peut être placé soit rétrograde (à travers la valve aortique) ou par ponction apical. L'avantage de rétrograde est que position est plus uniforme et il évite la nécessité d'une ponction apical et les risques concomitants de lésions coronaires ou une perte de la précharge. Toutefois, le placement rétrograde peut parfois être très difficile, donc nous décrire à la fois techniques ici. Fixer un cathéter 1,4 pression-volume français au système de boucle de volume de pression. Calibrer le système chaud KHB selon les instructions du fabricant. Veiller à la forme d'onde est visible en temps réel. Amener le cathéter et les câbles à proximité de la surface du VG afin de ne pas déloger après le placement. Pour le placement rétrograde, ouvrir la vanne réglable et nourrir le cathéter PV doucement à travers la valve aortique jusqu'à ce qu'une pression stable et le volume de forme d'onde sont identifiés. Évitez l'utilisation excessive de la force qui peut endommager la valve aortique ou de percer l'apex ventriculaire. REMARQUE: On a trouvé qu'il est important de réduire au minimum la longueur du tube et le nombre de spires que le cathéter PV doit traverser pour se rapprocher de l'AV. Ilpeut être utile pour réduire le tube qui est livré avec le système. Pour le placement apical, utiliser un 24 G angio-cathéter pour créer une perforation apicale dans le LV. Assurez-vous d'éviter la partie antérieure gauche artère coronaire descendante. Dirigez l'aiguille vers la valve aortique de l'apex du ventricule. Faire avancer le cathéter pression-volume dans le corps de la LV. Cesser de faire avancer le cathéter dès que la pression et le volume de la forme d'onde LV est identifiée. Une fois le cathéter pression-volume est en place, déplacer la chemise d'eau en position autour du cœur. Fixer le cathéter à la paroi de la chemise d'eau avec un petit morceau de ruban adhésif. Veiller à au moins une période de 30 min de la stabilité avant le début des mesures ou interventions. 8. La perfusion de médicaments (Facultatif) Infuser médicaments (par exemple, la dopamine) dans le bloc auriculaire gauche en utilisant une pompe de médicament standard. NOTE: Nous avons des médicaments dosés selon le groe corps animal poids depuis débit équivalent à un débit cardiaque entier passe à travers le bloc auriculaire; seule une petite partie de celle – ci passe par la circulation coronaire, comme il le fait in vivo. En variante, un second ensemble de perfusat peut être créé avec une concentration prédéfinie de médicament et utilisé pour perfuser le cœur. REMARQUE: Dans notre protocole, nous perfuser des médicaments sur une période de 12 min, la collecte des données physiologiques au cours de la dernière 10 min de chaque perfusion et en la comparant à une base de 10 minutes précédant immédiatement. 9. Physiologique Manipulations Rythme cardiaque (Facultatif) suture deux fils de stimulation sur la paroi de l'oreillette droite et le joindre à un dispositif de stimulation temporaire. NOTE: Cela permet un contrôle précis de la fréquence cardiaque (au-dessus du taux de sinus natif) et une compréhension de la relation entre la fréquence cardiaque et de la contractilité indépendante d'un médicament cardiotonique. Preload Varier lapré-charge (défini comme le volume d'extrémité gauche ventriculaire diastolique) en faisant varier la hauteur de la colonne d'alimentation du bloc auriculaire gauche. Tension artérielle Manipuler la pression sanguine (le principal déterminant de la postcharge dans ce modèle) en utilisant les valves de pression sur le IH-51. contenu coronaire d'oxygène Réaliser divers degrés d'hypoxie du myocarde en perfusant le coeur avec du KHB saturé dans divers mélanges de gaz. Pour ce faire, en utilisant des réservoirs gainés séparés (chacun avec son propre mélange de gaz) pour assurer l'équilibre entre le gaz et KHB. Accomplir ischémie coronarienne par suture ligaturer une artère coronaire distale. REMARQUE: La ligature des artères coronaires proximales dans le mode de travail cardiaque peut entraîner un dysfonctionnement du myocarde mortels. Provoquer ischémie coronarienne globale en interrompant ou en retardant une perfusion rétrograde pour une période de temps définie.