Грызун Рабочая модель сердца по изучению инфарктом производительности и потребления кислорода

Этот протокол выполняется в соответствии с текущим протоколом в рамках ухода за животными и использование комитета учреждения. 1. Подготовка к изучению Включите водяной бане, чтобы нагреть Кребса-буфер (КАХАБ) резервуар (установлен на 42 ° С). Приготовьте 16 л ХО , содержащий (в мМ) 128 NaCl, 5,7 KCl, 1,3 MgSO 4, 25 NaHCO 3, 2,7 CaCl 2, 0,53 ЭДТА, 0,54 наК 3 H 3 O 3, и 10,8 декстроза. 13 Подложка массы следующим образом : 27,584 г NaCl, 1,58 г KCl, 0,578 г MgSO 4, 8,401 г NaHCO 3, 1,47 г CaCl 2, 0,744 г ЭДТА, 0,22 г NAC 3 H 3 O 3, и 7,208 г декстрозы. Примечание: эти компоненты могут быть сохранены в конические пробирки в порошкообразной форме для составления в день эксперимента. Фильтр 4 л деионизированной воды через 0,22-микронный фильтр. Добавить 3,7 л этой воды до 4 лмерный стакан. Добавьте все компоненты для CaCl 2 в воде , за исключением. Растворить CaCl 2 в оставшиеся 300 мл воды с использованием отдельной мензурку. Кислородсодержащих соединений раствор с 95% O 2/5% CO 2 в 1 л / мин (LPM) в течение 5 мин. Это корректирует рН до 7,40 и улучшает растворение CaCl 2. Добавьте CaCl 2 в оставшейся части КАХАБ. Добавьте заполненный ХО в резервуар и циркулировать через все трубки в течение 30 мин. Убедитесь в том, что система свободна от макроскопических пузырьков. Кислородсодержащих с 95% O 2/5% CO 2 при 0,5 LPM. Примечание: KHB могут храниться в течение ночи в холодильнике не более 1 – 2 дней, вернули до комнатной температуры и повторно фильтруют для использования. Не используйте повторно ХО между экспериментами. Подготовьте 2 х 50 мл чистого мензурки со льдом холодной КАХАБ и поместите их в ведро льда возле станции рассечение. Убедитесь в том, что KHB лед холодный (а не охлажденные) перед экс посадка сердце. Поместите микро давления объем (PV) катетер в 10 мл шприц с фильтрованной КАХАБ в течение 30 мин до калибровки, в соответствии с инструкциями изготовителя. Примечание: Температура ХО используется, чтобы впитать PV катетер должен быть как можно ближе к 37 ° C, насколько это возможно. Подготовка анестезии и рассекает станции для животного. Обеспечить достаточную изофлуран в резервуаре. Оформи 500 ед гепарина в 1 мл шприц; поместите иглу 26 калибра (1/2 ") на этом шприц. Подготовьте маску для обезболивающим животного. Установите давления в аорте блок перфузионного до 80 мм ртутного столба и левого предсердия (LA) блок-перфузионное давление до 10 мм ртутного столба. Открыть как аортальный блок и блок LA, чтобы позволить теплым KHB, чтобы капать. Когда все готово, препарировать животное, открыть аортальный блок, чтобы обеспечить постоянное медленное капельное ХО вне. Откалибруйте PV катетера в соответствии с инструкциями производителя. "> 2. Подготовка животных и Препарирование ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения наилучших результатов убедитесь, что животное находится в интервале от 300 до 500 г; мы обнаружили, что вес животного от 425 до 450 г идеально подходит для нашей системы. Обезболить животное в камере с помощью изофлуран (1 – 2%), пока животное находится в бессознательном состоянии. Передача животных на рассечение станции и поместите маску анестезии с изофлуран и кислорода на животное. Выполните носок щепотку для оценки уровня седации. Нанесите мазь ветеринара на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Вводят гепарин, 500 единиц внутрибрюшинно в брюшной полости. Разрешить 10 минут для гепарин, чтобы быть поглощенными. Закрепить конечности животного с лентой для улучшения визуализации грудной клетке. Вскрытие сердца. После того, как обеспечение того, что нет никакого ответа на носок крайнем случае, снять кожу от брюшной полости с пинцетом, а затем использовать ножницы, чтобы надрезать в брюшную полость, следуя кривой Тон диафрагме назад к заднему углу ребер. После того, как диафрагма видна, используя маленькие ножницы, разрезать вдоль передней поверхности диафрагмы следующие направления предыдущих сокращений, чтобы позволить для вступления в грудной клетке. Продлить каждый разрез вдоль подмышечной линии на двусторонней основе к подмышке. Примечание: Следующие шаги должны быть выполнены эффективно, поскольку вентиляция будет нарушена после того, как диафрагма надрезанные. Отвести грудную клетку кпереди от мечевидного отростка с помощью щипцов. Надрезать перикарда и плевры. Определить нижнюю полую вену (НПВ) и аорту чуть выше диафрагмы и спрячьте их гуртом кпереди тупыми щипцами. Используя большие, изогнутые ножницы, быстро сделать надрез через IVC и аортой, потянув за сердце и легкие из груди целиком. Вырезать пищевода, трахеи, брахиоцефальных артерий и вен цефально удалить сердце и легкие от грудной клетки. Вырежьте твоегоМИК ткани с этим блоком ткани. Будьте осторожны, чтобы не порезать проксимальной части восходящей аорты. Немедленно погрузите сердце и легкие в ледяном КАХАБ и перейти к устройству Лангендорфа, ранее созданной, как описано в шаге 1. 3. аортальный канюляция Поместите комплекс сердечно-легочной в плоском блюде и сориентировать сердце тимуса и крупных сосудов, стоящих перед экспериментатором и заднюю сторону легких лицом к столу. Растащить два лепестка тимуса и идентифицировать Взлет брахиоцефальных артерий от аорты. Накройте аорту через край тарелки и секут аорту, используя маленькие ножницы приблизительно 5 мм выше аортального клапана, только проксимально к взлету правой подключичной артерии. Примечание: Разрез должен давать чистый круглый круг – аорту в поперечном сечении. Если она смещена от угла (т.е. широкий овал)или неполной, повторите разрез, чтобы достичь желаемого результата. Это будет способствовать эффективному аортального катетеризацию. Использование 2 пары изогнутых щипцов по обе стороны от аорты, направлять аорту через аортальный канюлю (который должен быть медленно капает с КАХАБ). Аортальный клапан должен сидеть 1 – 2 мм ниже кончика канюли. После того, как аорта пункции, переставить щипцов перпендикулярно через аорту, чтобы удерживать аорту на месте. В качестве альтернативы, поместите небольшой зажим через аорту провести комплекс легких сердца на месте, что позволяет одной экспериментатора, чтобы завершить эту модель. Попросите помощника передать шелк 4-0 шов чуть ниже пинцета и галстук на место, перекручивание вокруг канюли и связывая несколько раз, как в передней части и позади сердца. Откройте полую иглу полностью, чтобы начать полную ретроградную аортального потока. Обратите внимание на сердце биться энергично. ПРИМЕЧАНИЕ: Если сердце не начнет быстро бить (~ 200 BPM) и энергично, топривязывать или канюля может быть перекрыта, один или оба из коронарных артерий. Если есть подозрение, снять галстук и переставить его подальше от коронарных артерий. Если сердце надувается и не бьется, канюля может быть через аортальный клапан. В случае утечки коронарной артерии (KHB спреи от корня аорты), авансовый канюля ближе к аортального клапана (это явление может произойти, если брахиоцефальный артерии вводить иглу на месте восходящей аорты). 4. легочная вена окклюзия и подготовка легочную артерию пункции Примечание: Цель этого шага заключается в создании замкнутого левого предсердия системы, чтобы убедиться, что весь объем и давление со стороны левого предсердия блока передается слева структур сердца. Неспособность полностью закупорить легочных вен может привести к дефициту преднагрузки и могут фальсифицировать результаты или создать нестабильную подготовки рабочей сердца. Удалить тимус, чтобы улучшить экспозицию йе легочной артерии (ПА). Вручную повернуть аортального канюлю таким образом, что задняя сторона сердца обращена к оператору. Рассеките из суда, ведущие к правого легкого. Приостановить правой легочной ткани с помощью щипцов для дальнейшего разграничить эти сосуды. Использование средних и больших хирургических зажимов (или швом), закупорить правой легочной артерии и вены и бронха с одного клипа. Резекцию правую дистальных легких к клипу. Примечание: Из-за трудностей в рассечения легочной артерии свободный, наша практика закупоривать легочных вен, разбухают легочной артерии, что делает его легче надрезать, не повреждая близлежащие структуры в модели бьющегося сердца. Повторите шаг 4.2 на левом легком. Примечание: потенциальные ловушки и решения проблем: После того, как обе легочные артерии поглощаются, правое предсердие будет заметно растягиваться и сердце может стать брадикардический. Это происходит потому, что правый желудочек становится сжатым газом. Если этого не происходит, то, вероятно, в PULMкоронарных вен не полной закупорки, и что предварительная нагрузка будет недостаточной для работы режима сердца. Если сердце не в состоянии поддерживать сердечный выброс после левого предсердия (LA) пункции и попытки перехода на работающем сердце (см ниже), рассмотреть вопрос о размещении дополнительных клипов или галстук вокруг легочной вены пней для закупоривания любой остаточной утечки. После того, как PAs поглощаются, однако, шаг 5 должны быть выполнены немедленно, чтобы свести к минимуму ишемии миокарда. Следует отметить, что некоторые исследователи надрезать легочной артерии до перевязки легочных вен, чтобы избежать повышения давления в правом желудочке. Легочная артериальная надрез Поверните аортального канюлю так, чтобы передняя сторона сердца обращена к оператору. Определение легочной артерии. Опять же, эта артерия может быть растянут. Используя небольшие ножницы делают поперечным надрез приблизительно 3 мм выше клапана легочной артерии. Примечание: Это будет немедленно сбросить давление и частота сердечных сокращений может увеличиваться. Бытьпричиной этого канюлю легко сместиться, вводить иглу легочной артерии после левого предсердия канюляция завершена. 5. Левый Мерцательная канюляция Поверните аортального канюлю так, чтобы левое предсердие сталкивается оператор. Используя маленькие ножницы, сделайте 2 – 3 мм разрез в верхней части тела левого предсердия, примерно 3 мм над атриовентрикулярному канавки. Поместите ушко левого предсердия канюлю перпендикулярно к плоскости митрального клапана и направлен к межпредсердной перегородке. Откройте канюлю LA, пока не потечет KHB. Убедитесь в том, что KHB теплая на ощупь (это быстро становится холодно, когда сидит в любой не рубашкой трубки), с тем чтобы избежать дисфункции миокарда вследствие гипотермии следующие перехода в режим работает. Переход к скорости капель во время пункции. Использование щипцов, чтобы держать против тяги, вставьте предсердии канюли в корпус левого предсердия, следя за тем, чтобы не использовать excessiве силы, которые могут разорвать предсердие. Примечание: Канюля ЛА должен быть установлен так, чтобы он находился в середине предсердия без какого-либо напряжения на предсердной стенки. Передаёт 4-0 шелковой нити вокруг тела левого предсердия и завяжите узел, чтобы создать уплотнение предсердия вокруг канюлей. Позаботьтесь, чтобы гарантировать, что задняя сторона левого предсердия входит в шву. Добавление дополнительных швов по мере необходимости. После того, как запечатанный, потянуть полую иглу назад 1 – 2 мм, так что он сидит в середине предсердие, а не против межпредсердной перегородке. Примечание: Наиболее распространенная причина, что сердце становится перфузии при переходе к работе в режим сердца является то, что канюля LA упрется в межпредсердной перегородке, которая закупоривает левого предсердия притока. Трассировка LA часто меняется , чтобы продемонстрировать собственное волну волны и V , когда канюля находится в правильном положении (см рисунок 2E). Открыть канюлей клапан LA полностью администрировать полной предварительной нагрузки в левое предсердие. следить заСкорость капельного из сердца (которое происходит от коронарного стоков). Убедитесь в том, что скорость капельного не изменяется, когда канюля LA открыта. Если это произойдет, предсердие завязать вокруг канюлей, как описано в шаге 6.4, так как это означает наличие утечек в системе. 6. легочную артерию канюляция и переход в режим рабочей сердца Если измерения потребления кислорода миокардом (или других веществ в сточных водах коронарного, например, уровни наркотиков или цитокинов), вставить 1/32 "гибкий шланг в предшествующем уровне разреза в легочной артерии. Примечание: Потребление кислорода измеряется как разница в содержании кислорода между левого предсердия перфузату и стоках легочной артерии 2. Для непрерывного измерения потребления кислорода миокардом, используют в линии кислородного электрода для сравнения левого предсердия и коронарного синуса сточные воды. Собирают коронарного синуса сточные воды (из обеих легочной артерии и капает из сердца) в градуированный цилИндера спланированное по времени количественной оценки коронарного потока. Рассчитать потребление кислорода миокардом , как описано ранее. 2 Переход к работе в режим сердца путем выключения ретроградную аортального насоса. Примечание: Когда это будет сделано, то давление становится LA давление предварительной нагрузки и резистор, который был ранее обеспечивая устойчивость к ретроградной насоса в режиме Лангендорфа теперь обеспечивает устойчивость к сердечный выброс, создавая среднее артериальное давление. Если среднее артериальное давление снижается ниже ~ 80 мм ртутного столба, причина, вероятно, связано либо предварительной нагрузки или функции миокарда. Скорее всего, проблема заключается в левого предсердия канюлю, которая должна быть скорректирована после перезапуска ретроградную насоса. 7. Вставка левого желудочка Volume давления Катетер Примечание: PV катетер может быть помещен либо ретроградный (через аортальный клапан), либо через апикальную прокола. Преимущество в том, что ретроградный рosition является более последовательным и устраняет необходимость в верхушечной пункции и сопутствующих рисков, связанных с коронарной травмы или потери преднагрузки. Тем не менее, ретроградной размещение иногда может быть очень сложным, поэтому мы опишем оба метода в настоящем документе. Приложить 1,4 французский давления объема катетера к системе контура объемного давления. Откалибруйте систему в теплой КАХАБ в соответствии с инструкциями изготовителя. Убедитесь, что форма сигнала отображается в режиме реального времени. Доведите катетер и кабели близко к поверхности ЛЖ, чтобы не смещать его в процессе размещения. Для размещения ретроградной откройте регулируемый клапан и кормить PV катетер осторожно через аортальный клапан, пока стабильное давление и объем сигнала не определены. Избегайте чрезмерного применения силы, которые могут привести к повреждению аортального клапана или прокола желудочков апекс. Примечание: Мы обнаружили, что важно, чтобы свести к минимуму длину труб и количество витков, что ФЭ катетер должен перемещаться, чтобы подойти к AV. Этоможет быть полезным, чтобы сократить трубку, которая поставляется вместе с системой. Для апикальной размещения используйте 24 G ангио-катетера, чтобы создать апикальный прокол в ЛЖ. Убедитесь в том, чтобы избежать левой передней нисходящей коронарной артерии. Направьте иглу в направлении клапана аорты от желудочковой верхушки. Продвигайте давление-объем катетера в тело ЛЖ. Остановка продвижения катетера, как только идентифицирован давление и объем сигнала LV. После того, как давление-объем катетера находится в месте, переместить водяной рубашки в положение вокруг сердца. Закрепите катетер к стенке водяной рубашки с небольшой кусочек ленты. Убедитесь, что по крайней мере 30 мин период стабильности перед началом каких-либо измерений или вмешательства. 8. Настой Медикаменты (Необязательно) Настаивать препараты (например, допамина) в левом предсердии блоке , используя стандартный медикаментозное насос. Примечание: У нас есть дозированные препараты в соответствии с Wholе массы тела животного, так как эквивалент потока в целом сердечного выброса проходит через предсердия блока; лишь небольшая часть этого проходит через коронарное кровообращение, как это происходит в естественных условиях. В качестве альтернативы, второй набор перфузату может быть создана с заданной концентрацией лекарственного средства и используется для обрызгивать сердца. Примечание: В нашем протоколе, мы вливать лекарства в течение течение 12 мин, собирая физиологическими данные в течение последних 10 мин каждого настоя и сравнения его с непосредственно предшествующей 10 мин исходного уровня. 9. Физиологические Манипуляции Частота сердцебиения (Необязательно) шовный два ЭКС провода на стенки правого предсердия и прикрепить к временному устройству стимуляцией. Примечание: Это позволяет точно контролировать частоту сердечных сокращений (выше собственной частоты синусового) и понимание взаимосвязи между ЧСС и сократимость независимым от кардиотонического лекарства. предварительная нагрузка Изменяютпредварительной нагрузки (определяемой как левого желудочка конечного объема диастолического) путем изменения высоты колонны, питающего левого предсердия блока. Кровяное давление Манипулирование кровяное давление (основным фактором, определяющим постнагрузки в этой модели) с использованием клапанов давления на IH-51. Ишемическая содержание кислорода Достигнуть различной степени гипоксии миокарда путем перфузии сердца с КАХАБ насыщенным в различных газовых смесях. Это можно сделать, используя отдельные резервуары с рубашкой (каждый со своей собственной газовой смеси) для обеспечения равновесия между газом и КАХАБ. Достичь коронарную ишемию швом лигирования дистальных коронарной артерии. ПРИМЕЧАНИЕ: перевязка проксимальных коронарных артерий в режиме рабочего сердца может привести к летальному дисфункции миокарда. Побудить глобальной коронарной ишемии путем прерывания или задержки ретроградную перфузию в течение определенного периода времени.