Knaagdier Werken Heart Model voor de Studie van hartspierprestatie en Oxygen Consumption

Dit protocol wordt uitgevoerd onder een huidige protocol onder de verzorging van dieren en het gebruik commissie van de instelling. 1. Voorbereiding voor de Studie Zet het waterbad van de Krebs-Henseleit buffer (KHB) reservoir (ingesteld op 42 ° C) te verwarmen. Bereid 16 l KHB bevattende (in mM) 128 NaCl, 5,7 KCI, 1,3 MgSO 4, 25 NaHCO3, 2,7 CaCl2, 0,53 EDTA, 0,54 NaCl 3 H 3 O 3 en 10,8 dextrose. 13 Het substraat massa's als volgt : 27,584 g NaCl, 1,58 g KCI, 0,578 g MgSO 4, 8,401 g NaHCO3, 1,47 g CaCl2, 0,744 g EDTA, 0,22 g NaCl 3 H 3 O 3 en 7,208 g dextrose. Opmerking: deze componenten in conische buizen worden opgeslagen in poedervorm zijn voor samenstelling op de dag van experimenteren. Filter 4 L gedeïoniseerd water door een 0,22 micron filter. Voeg 3.7 L van dit water naar een 4 Lbeker. Voeg alle componenten behalve CaCl 2 aan het water. Los het CaCl2 in de resterende 300 ml water met een apart bekerglas. Zuurstof de oplossing met 95% O2 / 5% CO 2 bij 1 l / min (LPM) gedurende 5 min. Dit corrigeert de pH tot 7,40 en verbetert oplossing van CaCl2. Voeg de CaCl 2 aan de rest van de KHB. Voeg de voltooide KHB een reservoir en circuleren door alle buizen gedurende 30 min. Zorg ervoor dat het systeem vrij is van macroscopische bellen. Oxygenaat met 95% O2 / 5% CO 2 bij 0,5 LPM. OPMERKING: KHB kan overnacht worden bewaard in de koelkast voor maximaal 1-2 dagen, teruggebracht naar kamertemperatuur en opnieuw gefiltreerd voor gebruik. Niet opnieuw KHB tussen de experimenten. Bereid 2 x 50 ml schone bekers met ijskoud KHB en leg ze in een emmer ijs in de buurt van de dissectie station. Zorg ervoor dat de KHB is ijskoud (in plaats van gekoeld) alvorens ex het planten van het hart. Plaats de micro druk-volume (PV) katheter in een 10 ml injectiespuit gevuld met gefilterd KHB gedurende 30 min voor kalibratie instructies van de fabrikant. OPMERKING: Temperatuur KHB gebruikt om te genieten van de PV katheter zo dicht mogelijk bij 37 ° C mogelijk is. Bereid de anesthesie en ontleden station voor het dier. Zorg voor voldoende isofluraan in het reservoir. Opstellen 500 U heparine in een 1 ml injectiespuit; plaats een 26 gauge (1/2 ") naald op de spuit. Bereid een masker voor verlamming van het dier. Stel de aorta blok perfusiedruk tot 80 mmHg en het linker atrium (LA) blok perfusiedruk tot 10 mmHg. zowel de aorta blok open en LA blok te laten warm KHB te druppelen uit. Als u klaar bent om het dier te ontleden, opent u de aorta blok aan een gestage langzame infuus van KHB out mogelijk te maken. Kalibreer de PV katheter volgens instructies van de fabrikant. "> 2. Animal Voorbereiding en Dissection LET OP: Voor het beste resultaat, zorgen voor dier is tussen 300 en 500 g; Wij hebben gevonden dat een dier gewicht tussen 425-450 g ideaal voor ons systeem. Verdoven het dier in een tank af met isofluraan (1-2%) tot het dier bewusteloos. Breng het dier de dissectie station en plaats de anesthesie masker met isofluraan en zuurstof aan het dier. Voer teen knijpen om het niveau van sedatie te beoordelen. Solliciteer dierenarts zalf op de ogen tot droog te voorkomen dat tijdens het onder narcose. Injecteer heparine, 500 eenheden intraperitoneaal in de buikholte. Toestaan ​​10 min voor het Heparine kan worden geabsorbeerd. Bevestig de poten van het dier met tape om visualisatie van de thorax te verbeteren. Dissectie van het hart. Eenmaal zorgen ervoor dat er geen reactie op een teen knijpen, til de huid weg van de buikholte met een tang en vervolgens met een schaar om de peritoneale holte incisie, na de bocht thij membraan terug naar de achterste hoek van de ribben. Zodra het membraan zichtbaar, met behulp van kleine schaar, langs het voorste oppervlak van het membraan gesneden in de richting van de eerdere delen om voor binnenkomst in de thorax. Breid elke snede langs de oksel lijn bilateraal aan de oksel. OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd efficiënter, omdat de ventilatie in gevaar wordt gebracht zodra het membraan wordt ingesneden. Trek de ribbenkast naar voren uit de zwaardvormig proces met behulp van een tang. Incise het hartzakje en het borstvlies. Identificeer de onderste vena cava (IVC) en de aorta boven het membraan en trekken ze en bloc ventraal middels stompe tang. Met behulp van grote, gebogen schaar, snel een insnijding over de IVC en de aorta, het trekken van het hart en de longen uit de kist en bloc. Snijd de slokdarm, luchtpijp, brachycefale slagaders en aders craniale naar het hart en de longen van de thorax te verwijderen. Accijnzen de thymic weefsel met dit blok van weefsel. Zorg ervoor dat u het proximale deel van de opgaande aorta te snijden. Onmiddellijk Dompel het hart en de longen in ijskoud KHB en te verplaatsen naar de Langendorff apparaat, die eerder opgezet zoals beschreven in stap 1. 3. Aorta Canulatie Plaats de hart-long complex in een platte schaal en oriënteren het hart van de thymus en de grote vaten met uitzicht op de experimentator en het achterste deel van de longen met uitzicht op de tafel. Uit elkaar trekken de twee lobben van de thymus en identificeren van de start van de brachiocefale slagaders van de aorta. Draperen de aorta over de rand van de schaal en doorsnijden de aorta via kleine scharen van ongeveer 5 mm boven de aortaklep, net proximaal van de start van de rechter subclavia. NB: De incisie moet een schone ronde cirkel opleveren – de aorta in doorsnede. Als het off-hoek (dwz een breed ovaal)of onvolledige Herhaal de snede om het gewenste resultaat te bereiken. Dit zal efficiënt aorta canule vergemakkelijken. Gebruik 2 paar gebogen pincet aan weerszijden van de aorta, gids aorta via aorta canule (die langzaam worden druipt KHB). De aortaklep moet zitten 1-2 mm onder de punt van de canule. Na aorta canule, de positie van de tang loodrecht tegenover de aorta naar de aorta zijn plaats te houden. Als alternatief, plaats een kleine klem aan de overkant van de aorta naar het hart long complex zijn plaats te houden, zodat een enkele experimentator om dit model te voltooien. Laat een helper passeren een zijden 4-0 hechtdraad net onder de tang en das op zijn plaats, een lus rond de canule en koppelverkoop meerdere keren, zowel voor als achter het hart. Open de canule volledig volledige retrograde aorta stroom beginnen. Let op het hart heftig kloppen. NB: Als het hart is totaal niet te snel te verslaan (~ 200 BPM) en krachtig, detie of canule kan afsluitorgaan één of beide kransslagaders. Als dit wordt vermoed, verwijder de band en plaats deze weg van de kransslagaders. Als het hart uitzet en niet slaan, kan de canule worden over de aortaklep. Als de kransslagader lekken (KHB spuit uit de aortawortel), vooraf de canule dichter bij de aortaklep (dit verschijnsel kan optreden als een brachycefale slagader canule in plaats van de opgaande aorta). 4. Pulmonary Vein occlusie en Voorbereiding van de longslagader voor Canulatie Opmerking: Het doel van deze stap is om een ​​gesloten systeem te creëren linker atrium dat alle volume en druk van het linker atrium blok naar links hart structuren verzonden. Als u de pulmonale aderen volledig af te sluiten zou kunnen resulteren in preload deficiëntie en kunnen de resultaten vervalsen of maak een onstabiel werkend hart voorbereiding. Verwijder de thymus om de blootstelling van th te verbeterene longslagader (PA). Handmatig draai de aorta canule, zodat het achterste deel van het hart wordt geconfronteerd met de operator. Ontleden de vaten waardoor de rechterlong. Hang de rechter long weefsel met behulp van een tang om deze schepen verder af te bakenen. Met behulp van medium-large chirurgische clips (of hechtdraad), af te sluiten van de juiste longslagader en ader en bronchus met een enkele clip. Resectie van de rechter long distaal van de clip. LET OP: Als gevolg van moeilijkheden bij het ontleden van de longslagader gratis, onze praktijk is om de pulmonale aders af te sluiten om de longslagader opzwellen, waardoor het makkelijker om incise zonder verwonden de nabijgelegen structuren in een kloppend hart model. Herhaal stap 4.2 op de linkerlong. LET OP: Potentiële valkuilen en het oplossen van problemen: Als beide longslagaders worden afgesloten, zal de rechter atrium zichtbaar uitzetten en het hart kan bradycardische worden. Dit komt omdat het rechterventrikel druk wordt. Als dit niet gebeurt, is het waarschijnlijk dat de pulmDaarvoor kun- nen aderen niet volledig afgesloten, en dat de voorbelasting zal onvoldoende voor het werken hart modus. Als het hart niet in staat om het hartminuutvolume na het linker atrium (LA) infusen en probeerde overgang naar het hart (zie hieronder) te handhaven, worden overwogen om additionele klemmen of een band rond de longader stompen om eventuele lekken occluderen. Zodra de BO worden ingesloten echter Stap 5 onmiddellijk worden uitgevoerd myocardiale ischemie minimaliseren. Merk op dat sommige onderzoekers incisie de longslagader vóór ligatie van de pulmonaire aders druk zetten van het rechter ventrikel te vermijden. Pulmonale arteriële incisie Draai de aorta canule, zodat het voorste aspect van het hart wordt geconfronteerd met de operator. Identificeer de longslagader. Ook hier kan slagader opgezwollen. Met behulp van kleine schaar maken een dwarse incisie van ongeveer 3 mm boven de pulmonale klep. LET OP: Deze zal onmiddellijk verlichting van de druk en de hartslag kan verhogen. Wordenwant dit canule gemakkelijk loskomt, canule de longslagader na linkeratrium canule voltooid. 5. Left Atrial Canulatie Draai de aorta canule, zodat het linker atrium wordt geconfronteerd met de operator. Met de kleine scharen, maak een 2 – 3 mm incisie in het bovenlichaam van het linker atrium, ongeveer 3 mm boven de atrioventriculaire groef. Plaats het linker atrium canule loodrecht op het vlak van de mitralisklep en gericht is naar het atriale septum. Open de LA canule tot KHB stroomt. Zorg ervoor dat de KHB is warm aan (het koud snel bij het zitten in een niet-ommantelde buizen) om het myocard dysfunctie te voorkomen als gevolg van onderkoeling na de overgang naar het werken modus. Overgang naar een infuus tarief tijdens infusen. Met behulp van een tang om contra-tractie te houden, plaatst u de atriale canule in het lichaam van de linkerboezem, zorg niet te gebruiken excessive kracht, die het atrium kan scheuren. OPMERKING: De LA canule moet worden geplaatst dat het ligt in het midden van het atrium zonder spanning op de atriale wand. Laat een 4-0 zijden hechtdraad rond het lichaam van de linker atrium en een knoop om een ​​afdichting van het atrium rond de canule te creëren. Let erop dat het achterste deel van het linkeratrium is bij de hechtdraad. Voeg extra hechtingen nodig. Eenmaal gesloten, trek de canule terug 1-2 mm, zodat het zit in het midden van het atrium in plaats van tegen het atriale septum. LET OP: De meest voorkomende reden dat het hart raakt malperfused bij overgang naar beroepsleven hart modus is dat de LA canule grenst aan het atriale septum, waarbij het linker atrium instroom afsluit. De LA tracing verandert vaak om aan te tonen van een goede een golf golf en v wanneer de canule in de juiste positie (zie figuur 2E). Open de LA canule klep geheel de volledige voorspanning te dienen aan het linker atrium. bewaken van dedruppelen tarief van het hart (die afkomstig is van coronaire effluent). Zorg ervoor dat het infuus tarief niet veranderen wanneer de LA canule is open. Zo ja, retie het atrium rond de canule zoals beschreven in stap 6,4, omdat dit een lek in het systeem is. 6. longslagader Canulatie en Overgang naar Working Heart Mode Als het meten van myocard zuurstofverbruik (of andere stoffen in coronaire effluent, zoals drugs niveaus of cytokines), plaatst 1/32 "flexibele slang in de voorafgaande incisie in de longslagader. LET OP: Het zuurstofverbruik wordt gemeten als het verschil in zuurstofgehalte tussen links atriale perfusaat en longslagader effluent 2. Voor continue meting van myocardiale zuurstofconsumptie, gebruik van een in-line zuurstof elektrode naar het linker atrium en coronaire sinus effluent vergelijken. Verzamel coronaire sinus effluent (van zowel de longslagader en druipen van het hart) in een afgestudeerd cylinder voor getimede kwantificering van coronaire flow. Bereken myocardiale zuurstofverbruik zoals eerder beschreven. 2 Overgang naar beroepsleven hart modus door het uitschakelen van de retrograde aorta pomp. Opmerking: Wanneer dit gebeurt, de LA druk wordt de pre-laaddruk en de weerstand die eerder verschaffen weerstand tegen de retrograde pomp Langendorff modus verschaft nu weerstand hartminuutvolume, waardoor een gemiddelde arteriële druk. Als de gemiddelde arteriële druk daalt onder ~ 80 mm Hg, is de oorzaak waarschijnlijk gerelateerd aan ofwel preload of myocard-functie. De meest waarschijnlijke probleem is het linker atrium canule, aan te passen na het herstarten van de retrograde pomp. 7. Plaatsen van de linker ventriculaire druk Volume Catheter OPMERKING: De PV katheter kan worden gebracht hetzij retrograde (via de aortaklep) of via apicale punctie. Het voordeel is dat retrograde positie is consistenter en ondervangt de noodzaak van apicale punctie en de daarmee gepaard gaande risico's van coronaire letsel of verlies van voorbelasting. Echter, retrograde plaatsing soms zeer uitdagend, zodat we beide technieken beschrijven hierin. Bevestig een 1,4 French druk-volume katheter om de druk volume lussysteem. Kalibreer het systeem warme KHB volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat de golfvorm is zichtbaar in real time. Breng de katheter en kabels dichtbij het oppervlak van de LV om niet te los na plaatsing. Voor retrograde plaatsing, opent u de verstelbare klep en voeding van de PV-katheter zachtjes over de aortaklep, totdat een stabiele druk en het volume golfvorm worden geïdentificeerd. Vermijd het gebruik van buitensporig geweld die de aortaklep kunnen beschadigen of doorboren de ventriculaire apex. Opmerking: we hebben gevonden dat het belangrijk is om het buisstuk en het aantal omwentelingen dat de PV katheter moet doorlopen om de AV benaderen minimaliseren. Hetkan nuttig zijn om te bezuinigen de slang die wordt geleverd met het systeem. Voor apicale plaatsing, gebruik maken van een 24 G angio-katheter om een ​​apicale punctie in de LV te creëren. Zorg ervoor dat de linker anterieure dalende kransslagader te voorkomen. Richt de naald in de richting van de aortaklep uit de ventriculaire apex. Schuif de druk-volume katheter in het lichaam van de LV. Stop voortbewegen van de katheter zodra de LV druk en volume golfvorm geïdentificeerd. Zodra de druk-volume katheter op zijn plaats is, verplaatst het water jas in de juiste positie rond het hart. Bevestig de katheter aan de wand van het water jas met een klein stukje tape. Zorg ervoor dat op zijn minst een 30 min periode van stabiliteit voor het begin van de metingen of interventies. 8. Infusion of Medication (Optioneel) Giet medicijnen (bijvoorbeeld dopamine) in de linker atriale blok met behulp van een standaard medicijn pomp. NOTA BENE: Wij hebben gedoseerde medicijnen volgens de groe dierlijk lichaamsgewicht omdat stroom gelijk aan een geheel hartminuutvolume passeert de atriale blok; slechts een klein deel van deze gaat door de coronaire circulatie, zoals in vivo. Als alternatief kan een tweede reeks perfusievloeistof worden gemaakt met een vooraf ingestelde concentratie van medicatie en gebruikt om het hart perfuseren. Opmerking: In ons protocol, trekken we medicijnen gedurende een 12 minuten periode, verzamelen van fysiologische gegevens tijdens de laatste 10 minuten van elke infusie en te vergelijken met een onmiddellijk voorafgaande 10 minuten basislijn. 9. Fysiologische Manipulaties Hartslag (Optioneel) hechtdraad twee pacing draden op de rechter atriale wand en hechten aan een tijdelijke pacing apparaat. LET OP: Dit maakt een nauwkeurige controle van de hartfrequentie (boven de inheemse sinusritme) en een inzicht in de relatie tussen de hartslag en contractiliteit onafhankelijk van een cardiotonic medicatie. preload Varieer depreload (gedefinieerd als linker ventrikel eind diastolisch volume) door het variëren van de hoogte van de kolom toevoeren van het linker atrium blok. Bloeddruk Manipuleren van de bloeddruk (de primaire determinant van afterload in dit model) met behulp van de druk kleppen van de IH-51. Coronaire zuurstofgehalte Volbrengen verschillende mate van myocard hypoxie door perfuseren het hart met KHB verzadigd in verschillende gasmengsels. Gebruik hiervoor afzonderlijke mantel reservoirs (elk met een eigen gasmengsel) een evenwicht tussen het gas en KHB waarborgen. Volbrengen coronaire ischemie door hechtdraad ligeren een distale kransslagader. LET OP: De ligatie van proximale kransslagaders in de werkende hart modus kan leiden tot fataal disfunctie. Induceren globale coronaire ischemie door het onderbreken of uitstellen van retrograde perfusie voor een bepaalde periode.