心筋パフォーマンスと酸素消費量の研究のための齧歯類のワーキングハートモデル

このプロトコルは、金融機関の動物のケアと使用委員会の下に現在のプロトコルの下で行われます。 研究のための1.準備 （42°Cに設定）クレブス – ヘンゼライト緩衝液（KHB）貯水池を加熱するために水浴をオンにします。 （mM単位）128のNaCl、5.7のKCl、1.3 硫酸マグネシウム、25を含むKHBの16 LのNaHCO 3、2.7のCaCl 2、0.53 EDTA、0.54 NAC 3 H 3 O 3、および10.8ブドウ糖を準備します。13次のように基板の質量があります：27.584グラムのNaCl、1.58グラムのKCl、0.578グラムのMgSO 4、8.401グラムのNaHCO 3、1.47グラムののCaCl 2、0.744グラムのEDTA、0.22グラムのNAC 3 H 3 O 3、および7.208グラムのブドウ糖。 注：これらのコンポーネントは、実験の日に構成するための粉末形態でコニカルチューブに格納されてもよいです。 0.22ミクロンのフィルターを通して脱イオン水4リットルをフィルタリングします。 4 Lに、この水の3.7 Lを追加します。ビーカー。水へのCaCl 2を除いてすべてのコンポーネントを追加します。 別のビーカーを用いて水の残りの300ミリリットル中のCaCl 2を溶解させます。 5分間、1リットル/分（LPM）で、95％O 2/5％CO 2を含む溶液に酸素。これは、7.40のpHを修正し、 塩化カルシウムの溶解性を高めます。 KHBの残りの部分とのCaCl 2を追加します。 リザーバに完成したKHBを追加し、30分間、すべての管を通して循環します。システムは、巨視的に気泡がないことを確認してください。 0.5 LPMで95％O 2/5％CO 2と酸素化物。 注：KHBはわずか1冷蔵庫に一晩保存することができる – 2日間、室温に戻して、使用、再濾過しました。実験間でKHBを再利用しないでください。 2×50ミリリットルを氷冷KHBできれいにビーカーを用意し、解剖駅周辺の氷のバケツに配置します。元前KHBは氷冷（というよりもチルド）であることを確認してください心を植えます。 製造者の指示に従って、校正前の30分間、フィルタリングKHBで満たされた10ミリリットルの注射器にマイクロ圧力 – 容積（PV）カテーテルを配置します。 注：KHBの温度がPVカテーテルを浸すために使用可能な限り37°Cの近くに配置してください。 動物用の麻酔と解剖ステーションを準備します。 リザーバ内の適切なイソフルランを確認してください。 1mlシリンジ中のヘパリンの500 Uを描きます。この注射器の26ゲージ（1/2 "）の針を置く。動物を麻酔するためのマスクを準備します。 10 mmHgのに灌流圧をブロック80 mmHgのに大動脈ブロック灌流圧と左心房（LA）を設定します。暖かいKHBが出て滴下できるようにするために、大動脈ブロックとLAのブロックの両方を開きます。とき動物を解剖する準備ができて、KHBの着実遅い点滴を可能にするために、大動脈ブロックを開きます。 製造者の指示に従って、PVカテーテルを校正。 "> 2。動物の準備および解剖注：最良の結果を得るために、確実に動物は300〜500グラムです。我々は、425〜450グラムの間の動物の体重は、私たちのシステムのための理想的であることを見出しました。 動物が意識不明になるまで – （2％1）イソフルランを用いて、チャンバー内に動物を麻酔。解剖ステーションに動物を移し、動物にイソフルランと酸素と麻酔マスクを配置します。鎮静のレベルを評価するためにつま先のピンチを実行します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。 ヘパリン、腹腔内の500台の腹腔内に注入します。ヘパリンのための10分を吸収することができます。胸部の可視化を強化するためにテープで動物の手足を固定します。 心臓の解剖。 いったんつま先のピンチに応答がないことを確認して、トンの曲線以下、腹膜腔を切開するはさみを使用して、次にピンセットで腹腔から肌を持ち上げ、彼は、リブの後部角に戻ってダイヤフラム。 ダイアフラムたら胸部への参入を可能にするために、前カットの方向以下の振動板の前面に沿って切断し、小さなハサミを使用して、表示​​されています。腋窩に、両側腋窩線に沿って各カットを拡張します。 注：ダイヤフラムが切開されると、換気が損なわれますので、次の手順を効率的に行うべきです。 鉗子を使用して、剣状突起から前方胸郭を撤回。心膜および胸膜を切開。 ちょうど横隔膜の上に下大静脈（IVC）と大動脈を特定し、前方鈍ピンセットを用いて一括して撤回。 大規模な、湾曲したハサミを使用して、急速にIVCと大動脈を横断切開を行い、 一括胸から心臓や肺を引っ張ります。胸部から心臓や肺を除去するために、食道、気管、腕頭動脈と静脈頭をカットします。なたを切り出します組織のこのブロックでマイク組織。上行大動脈の近位部をカットしないように注意してください。 すぐに氷のように冷たいKHBで心臓や肺を浸すと、ステップ1で説明したように、以前に設定しランゲンドルフ装置に移動します。 3.大動脈カニューレ挿入平らな皿に心肺複合体を置き、実験者とテーブルが直面している肺の後面に面した胸腺および大血管と心を向けます。胸腺の2つのローブを離れて引っ張り、大動脈から腕頭動脈の離陸を識別します。 皿の縁の上に大動脈を羽織ると、約5ミリメートルの大動脈弁上に小さなはさみ、右鎖骨下動脈の離陸のすぐ近位を使用して大動脈を横断。 注：切開がきれいな丸い円を得なければならない – 断面で大動脈を。それはオフ角度である場合（ すなわち、ワイドオーバル）または不完全な、所望の結果を達成するために、カットを繰り返します。これは、効率的な大動脈挿管を容易にするであろう。 大動脈のいずれかの側に湾曲した鉗子の2ペアを使用して、（ゆっくりKHBで滴下する必要があります）、大動脈カニューレを介して大動脈を導きます。 2ミリメートルカニューレの先端の下に – 大動脈弁は1座る必要があります。 大動脈カニューレ挿入した後、所定の位置に大動脈を保持するために、大動脈を横切って垂直に鉗子の位置を変更します。また、このモデルを完成するために、単一の実験を可能にする、所定の位置に心臓肺複合体を保持するために大動脈の両端に小さなクランプを配置します。 アシスタントはちょうど鉗子の下に絹4-0縫合糸を渡すとカニューレの周りにループして目の前にし、心臓の後ろの両方を複数回同点、所定の位置に結ぶ必要があります。完全な逆行性大動脈流を開始するために、完全にカニューレを開きます。積極的に心拍を確認します。 注：心は急速に（〜200 BPM）を打つために始めて、激しくていない場合は、ネクタイまたはカニューレは、冠状動脈の一方または両方を閉塞することができます。これが疑われる場合は、ネクタイを削除し、冠状動脈からそれを離れて再配置します。心臓が膨張するとビートしていない場合、カニューレは、大動脈弁を横断することができます。冠動脈漏れ（大動脈根からKHBスプレー）した場合、（腕頭動脈が上行大動脈の代わりにカニューレを挿入する場合、この現象が発生する可能性があります）大動脈弁に近いカニューレを進めます。 4.肺静脈閉塞症およびカニューレ挿入のための肺動脈の調製注：このステップの目的は、左心房のブロックからのすべてのボリュームと圧力が左心構造に伝達されることを確実にするために、閉じた左心房のシステムを作成することです。完全に肺静脈を閉塞しないと、プリロードの欠乏につながる可能性があり、その結果を改ざんまたは不安定な作業の心の準備を作成することができます。 目の露出を改善するために胸腺を削除します電子肺動​​脈（PA）。 心臓の後面がオペレータを向くように手動で大動脈カニューレを回転させます。右肺につながる血管を解剖。さらにこれらの血管を描写するために鉗子を使用して、右肺組織を一時停止します。中・大規模な外科用クリップ（または縫合糸）を使用して、単一のクリップで右肺動脈と静脈と気管支を閉塞。クリップに右肺の先端を切除。 注：肺動脈が自由解剖の難しさのため、私たちの練習は、拍動する心臓モデルで近くの構造を傷つけることなく、切開することが容易になり、肺動脈を拡張させるために肺静脈を閉塞することです。 左肺上の手順を繰り返し4.2。 注：潜在的な落とし穴と問題解決：両方の肺動脈が閉塞されると、右心房は目に見えて膨張され、心は徐脈になることがあります。右心室が加圧になるためです。これが発生しない場合、それはpulm可能性がありますonary静脈が完全に閉塞されていない、とその予圧は、心臓の作業モードには不十分になります。心臓が（下記参照）、左心房（LA）挿管し、心臓を作業しようとしたの移行後に心拍出量を維持することができない場合には、追加のクリップまたは任意の残留リークを閉塞するために肺静脈の切り株の周りにネクタイを配置することを検討。 PAが閉塞されると、ただし、ステップ5は、心筋虚血を最小限に抑えるために、すぐに行うべきです。一部の研究者は、右心室の加圧を回避するために、前に肺静脈の結紮に肺動脈を切開することに注意してください。 肺動脈切開心の前部側面は、オペレータを向くように大動脈カニューレを回転させます。肺動脈を識別します。再び、この動脈が膨張してもよいです。小さなはさみを使用すると、約3ミリメートル肺動脈弁の上に横切開を行います。 注：これは、すぐに圧力を開放し、心拍数を増加させることができます。ありますこのカニューレは、追い出し左心房のカニューレ挿入が完了した後に肺動脈にカニューレを挿入することは容易である引き起こします。 5.左心房カニューレ挿入左心房は、オペレータを向くように大動脈カニューレを回転させます。約3ミリメートル房室溝の上に、左心房の上半身に3ミリメートルの切開 – 小さなはさみを使用して、2を作ります。 僧帽弁の面に垂直な左心房のカニューレを置き、心房中隔に向かって指摘しました。 KHBが流れ出るまでLAカニューレを開きます。作業モードへの移行以下の低体温症に起因する心筋機能障害を避けるために（任意の非ジャケット付きのチューブに座ったとき、それはすぐに寒くなる）KHBに触れたときに熱くなっていることを確認してください。挿管時の滴下速度への移行。 excessiを使用しないように注意しながら、左心房の体内に心房カニューレを挿入し、カウンタートラクションを保持するために鉗子を使用してアトリウムを引き裂くことができる力を、VEの。 注：それは心房壁上の任意の緊張せずに心房の真ん中に座っているように、LAカニューレが配置されるべきです。 左心房の体の周りに4-0絹縫合糸をパスし、カニューレの周囲の心房のシールを作成するための結び目を作ります。左心房の後面は、縫合糸に含まれていることを確認するように注意してください。必要に応じて追加の縫合糸を追加します。それはむしろ心房中隔に対するよりも心房の真ん中に座っているように、2ミリメートル – 密封された後、バック1をカニューレを引きます。 注：心臓は心臓の作業モードへの移行時にmalperfusedになることが最も一般的な理由は、LAカニューレが左心房の流入を閉塞心房中隔を、当接していることです。 LAは、多くの場合、トレース（ 図2Eを参照）カニューレが適切な位置にあるときに、適切な波とV波を実証するために変更されます。 左心房への完全なプリロードを管理するために完全にLAカニューレバルブを開きます。モニター（冠状動脈流出物から来る）は、心臓からの滴下速度。 LAカニューレが開いているときに点滴速度が変化しないことを確認してください。それがない場合は、ステップ6.4で説明したように、これは、システム内の漏れを表しているように、カニューレの周りのアトリウムを結び直します。 6.肺動脈カニューレ挿入およびワーキングハートモードへの移行心筋酸素消費量（またはそのような薬剤レベルまたはサイトカインなどの冠状動脈流出液中の他の物質を、）を測定する場合には、肺動脈内の前切開部に1/32 "フレキシブルチューブを挿入します。 注：酸素消費量は、左心房灌流液および肺動脈流出物の間の酸素含有量の差として測定される2。 心筋酸素消費量を連続的に測定するために、左心房および冠状静脈洞の流出物を比較するためのインライン酸素電極を使用しています。 卒業CYLに（心臓から肺動脈と滴下両方から）冠状静脈洞の流出液を収集冠血流の時限定量化のためインダー。 前述のように、心筋酸素消費量を算出する。2 逆行性大動脈ポンプをオフにすることによって、心臓の作業モードへの移行。 注：これが行われると、LA圧が予めランゲンドルフ・モードで逆行ポンプに対する耐性を提供した前負荷圧と抵抗が現在平均動脈圧を作り出す、心拍出量に対する耐性を与えるなります。 〜80 mmHgの下の平均動脈圧が低下した場合、原因はおそらくプリロードまたは心筋機能のいずれかに関連しています。最も可能性の高い問題は逆行ポンプを再起動した後に調整する必要があり、左心房カニューレ、です。 左心室圧力ボリュームカテーテルの7.挿入注：PVカテーテルは逆行（大動脈弁を介して）または頂端穿刺を介してのいずれかで配置されてもよいです。逆行性の利点は、pとしますositionは、より一貫性があり、それは、頂端穿刺および冠動脈損傷または予圧の損失の付随リスクを不要にします。しかし、逆行配置は、時には非常に挑戦することができますので、私たちは、ここで両方のテクニックを説明します。 圧力ボリュームループシステムに1.4フレンチ圧 – 容積カテーテルを取り付けます。製造元の指示に従って温かいKHBでシステムを調整します。波形がリアルタイムで表示されていることを確認します。配置後、それを除去しないようにカテーテルおよびLVの表面に近いケーブルを持参してください。 逆行配置するために、調整可能なバルブを開放し、安定した圧力と体積の波形が特定されるまで大動脈弁をそっとPVカテーテルを養います。大動脈弁を損傷または心室尖部を穿刺することができる力の過度の使用は避けてください。 注：我々は、チューブとPVカテーテルはAVに近づくように移動しなければならないターン数の長さを最小限にすることが重要であることを見出しました。それシステムに付属のチューブを削減することが有益であり得ます。 頂端に配置するため、LVで頂端穿刺を作成するために、24のGアンギオカテーテルを使用しています。左冠動脈前下行枝を避けるようにしてください。心室頂部から大動脈弁に向かって針を目指します。 LVの体内に圧 – 容積カテーテルを進めます。すぐにLV圧力と体積の波形が識別されるようにカテーテルを前進停止します。 圧 – 容積カテーテルが適所に配置されると、心臓の周りの位置にウォータージャケットを移動します。テープの小片でウォータージャケットの壁にカテーテルを固定します。 前の任意の測定または介入を開始する安定性の少なくとも30分の期間を確認してください。 薬の8.注入 （オプション）標準投薬ポンプを使用して、左心房ブロックに薬（ 例えば、ドーパミン）をインフューズ。 注：私たちはwholに従って薬を投与しています電子動物の体重全体の心拍出量に相当する流れは、心房ブロックを通過するからです。それは生体内で行うようにこれだけの小さな部分は、冠循環を通過します。また、灌流液の第2のセットは、薬物の設定濃度で作成し、心臓を灌流するために使用することができます。 注：我々のプロトコルでは、各注入の最後の10分の間に生理学的データを収集し、直前の10分間のベースラインに比較して、12分間にわたって薬物を注入します。 9.生理的マニピュレーション心拍数右心房壁にワイヤをペーシング（オプション）縫合糸2と、一時的ペーシングデバイスに接続します。 注：これは、（天然の洞レート上）心拍数と心拍数及び強心薬の収縮独立の関係の理解の正確な制御を可能にします。 プレロード変わります左心房のブロックに供給された列の高さを変えることにより予圧（左心室拡張末期容積と定義されます）。 血圧 IH-51の圧力バルブを使用して、血圧（このモデルでは後負荷の主要な決定因子）を操作します。 冠状動脈酸素含有量種々のガス混合物に飽和KHBで心臓を灌流することにより、心筋の低酸素症の様々な程度を達成。ガスとKHB間の平衡を確保するために、別々のジャケット付き貯水池（独自のガス混合物と各）を使用して行います。 遠位冠状動脈を結紮縫合することにより冠動脈虚血を達成。 注：作業心臓モードの近位冠状動脈の結紮は、致命的な心筋機能障害をもたらすことができます。 定義された期間のための逆行性灌流を中断または遅延させることにより、グローバルな冠動脈虚血を誘導します。