Roedor de Trabajo Modelo del corazón para el estudio sobre los resultados de miocardio y el consumo de oxígeno

Este protocolo se lleva a cabo bajo un protocolo actual con comité de cuidado de los animales y el uso de la institución. 1. Preparación para el Estudio Encienda el baño de agua para calentar el depósito tampón de Krebs-Henseleit (KHB) (ajustado a 42 ° C). Preparar 16 l de KHB que contiene (en mM) 128 NaCl, 5,7 KCl, 1,3 MgSO 4, 25 NaHCO 3, 2,7 CaCl 2, 0,53 EDTA, 0,54 NaCl 3 H 3 O 3, y 10,8 dextrosa. 13 Las masas de sustrato son las siguientes : 27.584 g de NaCl, 1,58 g de KCl, 0,578 g de MgSO4, 8.401 g de NaHCO3, 1,47 g de CaCl2, 0,744 g de EDTA, 0,22 g de NaCl 3 H 3 O 3, y 7.208 g de dextrosa. Nota: estos componentes pueden ser almacenados en tubos cónicos en forma de polvo para su constitución en el día de la experimentación. Filtro 4 L de agua desionizada a través de un filtro de 0,22 micras. Añadir 3,7 L de esta agua a un 4 Lcubilete. Añadir todos los componentes a excepción de CaCl 2 al agua. Disolver el CaCl 2 en los restantes 300 ml de agua usando un vaso de precipitados separado. Oxigenar la solución con 95% O 2/5% de CO 2 a 1 L / min (LPM) durante 5 min. Esto corrige el pH a 7,40 y mejora la disolución de CaCl2. Añadir la CaCl 2 para el resto de la KHB. Añadir la KHB completado a un depósito y circular a través de todos los tubos durante 30 min. Asegúrese de que el sistema está libre de burbujas macroscópicas. De compuestos oxigenados con un 95% de O2 / 5% de CO 2 a 0,5 LPM. NOTA: KaJaB se puede almacenar durante la noche en el refrigerador durante no más de 1 – 2 días, llevó de nuevo a temperatura ambiente y se volvió a filtrar para su uso. No vuelva a utilizar KaJaB entre los experimentos. Preparar 2 x 50 ml vasos limpios con KHB enfriado con hielo y colocarlos en un cubo de hielo cerca de la estación de disección. Asegúrese de que el KaJaB es fría como el hielo (en lugar de frío) antes de ex plantar el corazón. Coloque el micro catéter de presión-volumen (PV) en una jeringa de 10 ml lleno de KHB filtrada para 30 min antes de la calibración, según las instrucciones del fabricante. NOTA: La temperatura del KaJaB usa para remojar la sonda PV debe ser lo más cercano a 37 ° C como sea posible. Preparar la anestesia y de la estación de disección para el animal. Asegúrese de isoflurano adecuada en el depósito. Elaborar 500 U de heparina en una jeringa de 1 ml; colocar una aguja de calibre 26 (1/2 ") en esta jeringa. Preparar una máscara para anestesiar al animal. Ajuste la presión de perfusión aórtica bloque de 80 mmHg y la aurícula izquierda (LA) la presión de perfusión bloque de 10 mmHg. tanto el bloque aórtica abierta y el bloque de Los Ángeles para dejar que se caliente KaJaB a gotear. Cuando esté listo para diseccionar el animal, abrir el bloque de la aorta para permitir un lento goteo constante de KHB a cabo. Calibrar el catéter PV de acuerdo con las instrucciones del fabricante. "> 2. Preparación de los animales y disección NOTA: Para obtener los mejores resultados, asegúrese de animales es entre 300 y 500 g; se ha encontrado que un peso animal entre 425-450 g es ideal para nuestro sistema. Anestesiar al animal en una cámara utilizando isoflurano (1-2%) hasta que el animal está inconsciente. Transferir el animal a la estación de disección y colocar la máscara de anestesia con isoflurano y oxígeno en el animal. Realizar pizca dedo del pie para evaluar el nivel de sedación. Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Inyectar heparina, 500 unidades intraperitoneal en la cavidad abdominal. Permita 10 minutos para la heparina que se absorba. Fije las extremidades del animal con cinta para mejorar la visualización del tórax. La disección del corazón. Una vez asegurando que no hay respuesta a una pizca dedo del pie, levantar la piel fuera de la cavidad abdominal con una pinza y luego usar las tijeras para incidir en la cavidad peritoneal, siguiendo la curva de la tque el diafragma de nuevo a el ángulo posterior de las costillas. Una vez que el diafragma es visible, el uso de pequeñas tijeras, cortados a lo largo de la superficie anterior de la membrana siguiendo la dirección de los cortes antes de permitir la entrada en el tórax. Extender cada corte a lo largo de la línea axilar bilateral a la axila. NOTA: Los siguientes pasos se deben realizar de manera eficiente ya que la ventilación se verá comprometida una vez que se realiza una incisión del diafragma. Retraer la caja torácica anterior de la apófisis xifoides el uso de fórceps. Incisión en el pericardio y la pleura. Identificar la vena cava inferior (VCI) y la aorta justo por encima del diafragma y retractarse en bloque anterior utilizando pinzas romas. Con unas tijeras grandes, abombados, rápidamente hacer una incisión a través de la vena cava inferior y la aorta, tirando el corazón y los pulmones fuera del tórax en bloque. Cortar el esófago, la tráquea, las arterias y las venas braquiocefálica cefálicos para quitar el corazón y los pulmones desde el tórax. Escindir el thytejido de micro con este bloque de tejido. Tenga cuidado de no cortar la parte proximal de la aorta ascendente. Inmediatamente sumerja el corazón y los pulmones en KHB enfriado con hielo y pasar al aparato de Langendorff, configurado previamente como se describe en el paso 1. 3. La canulación aórtica Coloque el complejo de corazón-pulmón en un plato plano y orientar el corazón con el timo y los grandes vasos que se enfrenta el experimentador y la cara posterior de los pulmones frente a la mesa. Separar los dos lóbulos del timo e identificar el despegue de las arterias braquiocefálica de la aorta. Coloque la aorta por encima del borde del plato y seccionar la aorta utilizando unas tijeras pequeñas de aproximadamente 5 mm por encima de la válvula aórtica, justo proximal al despegue de la arteria subclavia derecha. NOTA: La incisión debe producir un círculo alrededor de limpia – la aorta en la sección transversal. Si es fuera de ángulo (es decir, una amplia ovalada)o incompleta, repetir el corte para lograr el resultado deseado. Esto facilitará la canulación aórtica eficiente. Uso de 2 pares de pinzas curvas a ambos lados de la aorta, guiar a la aorta a través de la cánula aórtica (que debe ser goteando lentamente con KHB). La válvula aórtica debe sentarse 1 – 2 mm por debajo de la punta de la cánula. Después de la canulación de la aorta, vuelva a colocar las pinzas de forma perpendicular por la aorta para mantener la aorta en su lugar. Como alternativa, coloque una pequeña pinza a través de la aorta para mantener el complejo de corazón-pulmón en su lugar, lo que permite un solo experimentador para completar este modelo. Tiene un asistente pasar una sutura de seda 4-0 justo debajo de la pinza y la corbata en su lugar, un bucle alrededor de la cánula y atar varias veces tanto por delante y por detrás del corazón. Abra la cánula completamente para comenzar completo flujo aórtico retrógrado. Observe que el corazón lata con fuerza. NOTA: Si el corazón no empieza a latir rápidamente (~ 200 BPM) y vigorosamente, laatar o cánula puede ser ocluir una o ambas de las arterias coronarias. Si esto se sospecha, quitar la corbata y cambiarlo de posición de las arterias coronarias. Si el corazón se dilata y no se anda, la cánula puede ser a través de la válvula aórtica. Si las fugas de la arteria coronaria (sprays KHB de la raíz aórtica), el avance de la cánula más cerca de la válvula aórtica (este fenómeno puede ocurrir si una arteria braquiocefálica es canular en lugar de la aorta ascendente). 4. pulmonar oclusión de la vena y la preparación de la arteria pulmonar para la canalización NOTA: La finalidad de este paso es crear un sistema de la aurícula izquierda cerrada para asegurar que todo el volumen y la presión del bloque de la aurícula izquierda se transmite a las estructuras del corazón izquierdo. El fracaso para ocluir completamente las venas pulmonares podría resultar en deficiencia de precarga y puede falsificar los resultados o crear una preparación de corazón de trabajo inestable. Retire el timo para mejorar la exposición de THarteria pulmonar e (PA). girar manualmente la cánula aórtica de modo que la cara posterior del corazón está orientada hacia el operador. Diseccionar los vasos que llegan al pulmón derecho. Suspender el tejido pulmonar derecha utilizando fórceps para delimitar más estos vasos. El uso de clips quirúrgicos tamaño medio-grande (o de sutura), ocluir la arteria pulmonar derecha y la vena y el bronquio con un solo clip. Resecar el pulmón derecho distal al clip. NOTA: Debido a la dificultad en la disección de la arteria pulmonar libre, nuestra práctica es para ocluir las venas pulmonares para distender la arteria pulmonar, lo que es más fácil hacer una incisión sin dañar las estructuras cercanas en un modelo de corazón que late. Repita el paso 4.2 en el pulmón izquierdo. NOTA: peligros potenciales y la resolución de problemas: Una vez que se ocluyen ambas arterias pulmonares, la aurícula derecha visiblemente cierta dilatación y el corazón puede llegar a ser bradicardia. Esto es porque el ventrículo derecho se convierte en presión. Si esto no ocurre, es probable que el pulmonary venas no están completamente ocluida, y que la precarga serán insuficientes para el modo de trabajo del corazón. Si el corazón no es capaz de mantener el gasto cardíaco después de la canulación de la aurícula izquierda (LA) y el intento de transición al corazón (véase más adelante) de trabajo, considerar la colocación de clips adicionales o un lazo alrededor de los tocones de las venas pulmonares para ocluir cualquier fuga residual. Una vez que las áreas protegidas se ocluyen, sin embargo, el paso 5 debe realizarse inmediatamente para minimizar la isquemia miocárdica. Tenga en cuenta que algunos investigadores incise la arteria pulmonar antes de la ligadura de las venas pulmonares para evitar la presurización del ventrículo derecho. incisión arterial pulmonar Girar la cánula aórtica de modo que la cara anterior del corazón se enfrenta el operador. Identificar la arteria pulmonar. Una vez más, esta arteria puede ser distendido. Utilizando unas tijeras pequeñas hacen una incisión transversal de aproximadamente 3 mm por encima de la válvula pulmonar. NOTA: Esta inmediato a aliviar la presión y el ritmo cardíaco puede aumentar. Serporque esta cánula es fácil de desplazar, canular la arteria pulmonar después de la canulación de la aurícula izquierda es completa. 5. La canulación de la aurícula izquierda Girar la cánula aórtica de modo que la aurícula izquierda se enfrenta el operador. El uso de las tijeras pequeñas, hacer un 2 – 3 mm incisión en el cuerpo superior de la aurícula izquierda, a unos 3 mm por encima del surco auriculoventricular. Coloque la cánula de la aurícula izquierda perpendicular al plano de la válvula mitral y apuntando hacia el tabique auricular. Abra la cánula hasta que fluye LA KaJaB. Asegúrese de que el KaJaB es caliente al tacto (que se enfríe rápidamente cuando se sienta en cualquier tubo no con camisa) con el fin de evitar la disfunción miocárdica debido a la hipotermia después de la transición al modo de trabajo. La transición a un ritmo de goteo durante la canulación. El uso de pinzas para sostener contra-tracción, insertar la cánula en el cuerpo fibrilación de la aurícula izquierda, teniendo cuidado de no utilizar excessive la fuerza, que puede rasgar el atrio. NOTA: La cánula LA debe colocarse de manera que se encuentra en medio de la aurícula sin ninguna tensión en la pared atrial. Pasar una sutura de seda 4-0 alrededor del cuerpo de la aurícula izquierda y haga un nudo para crear un sello del atrio alrededor de la cánula. Tener cuidado para asegurarse de que la cara posterior de la aurícula izquierda está incluido en la sutura. Añadir suturas adicionales según sea necesario. Una vez sellados, tire de la cánula de un 1 – 2 mm, de modo que se sienta en el medio del atrio en vez de contra el tabique auricular. NOTA: La razón más común que el corazón se malperfused en la transición al modo de trabajo del corazón es que la cánula LA colinda con el tabique auricular, que ocluye entrada de la aurícula izquierda. El trazado LA cambia a menudo para demostrar una adecuada una ola de onda y v cuando la cánula está en la posición correcta (ver Figura 2E). Abra la válvula de cánula LA completo para administrar la carga previa completa de la aurícula izquierda. Supervisar elritmo de goteo desde el corazón (que viene del efluente coronario). Asegúrese de que el ritmo de goteo no cambia cuando la cánula LA está abierto. Si lo hace, atar el atrio alrededor de la cánula como se describe en el paso 6.4, ya que esto representa una fuga en el sistema. 6. canulación de la arteria pulmonar y la transición al modo de trabajo del corazón Si la medición del consumo de oxígeno del miocardio (u otras sustancias en los efluentes coronaria, tales como los niveles de fármaco o citoquinas), inserte 1/32 "tubo flexible en la incisión previa en la arteria pulmonar. NOTA: El consumo de oxígeno se mide como la diferencia en el contenido de oxígeno entre perfundido de la aurícula izquierda y el efluente de la arteria pulmonar 2. Para la medición continua del consumo miocárdico de oxígeno, utilizar un electrodo de oxígeno en línea para comparar la aurícula izquierda y el efluente del seno coronario. Recoger el efluente del seno coronario (tanto de la arteria pulmonar y el goteo del corazón) en un cil graduadainder para la cuantificación temporizada de flujo coronario. Calcular el consumo de oxígeno del miocardio, como se describe anteriormente. 2 La transición al modo de trabajo del corazón apagando la bomba aórtica retrógrada. NOTA: Cuando se hace esto, la presión de LA se convierte en la presión de pre-carga y la resistencia que se proporciona previamente la resistencia a la bomba retrógrada en el modo de Langendorff ahora proporciona resistencia al gasto cardiaco, la creación de una presión arterial media. Si la presión arterial media desciende por debajo de ~ 80 mm Hg, la causa está probablemente relacionado con cualquiera de precarga o la función miocárdica. El problema más probable es que la cánula de la aurícula izquierda, el cual deberá ajustarse después de reiniciar la bomba retrógrada. 7. inserción del catéter volumen de la presión ventricular izquierda NOTA: El catéter PV puede ser colocada ya sea retrógrada (a través de la válvula aórtica) o por medio de punción apical. El beneficio de retrógrada es que pOSICIÓN es más consistente y que evita la necesidad de punción apical y los riesgos concomitantes de la lesión coronaria o la pérdida de la precarga. Sin embargo, la colocación retrógrada a veces puede ser muy difícil, así que describir ambas técnicas en el presente documento. Adjuntar un catéter de presión-volumen 1,4 francesa para el sistema de bucle presión-volumen. Calibrar el sistema en caliente KHB de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que la forma de onda es visible en tiempo real. Llevar el catéter y cables cerca de la superficie de la LV de modo que no se desprenda que después de la colocación. Para la colocación retrógrada, abra la válvula ajustable y alimentar el catéter PV suavemente a través de la válvula aórtica hasta que se identifiquen una presión estable y forma de onda de volumen. Evitar el uso excesivo de la fuerza que puede dañar la válvula aórtica o la punción de la punta del ventrículo. NOTA: Se ha encontrado que es importante para reducir al mínimo la longitud del tubo y el número de vueltas que el catéter PV debe navegar a acercarse a la AV. Esopuede ser útil para reducir la tubería que viene con el sistema. Para la colocación apical, use un angio-catéter 24 G para crear una punción apical en el VI. Asegúrese de evitar la descendente anterior de la arteria coronaria. Dirigir la aguja hacia la válvula aórtica desde el vértice del ventrículo. Avanzar el catéter de presión-volumen en el cuerpo de la LV. Deja de avanzar el catéter tan pronto como se identifica la forma de onda de presión y el volumen del VI. Una vez que el catéter de presión-volumen está en su lugar, mover la camisa de agua en su posición alrededor del corazón. Asegurar el catéter a la pared de la camisa de agua con un pequeño trozo de cinta. Asegurar como mínimo un período de 30 min de la estabilidad antes de comenzar cualquier medición o intervenciones. 8. La infusión de medicación (Opcional) Infundir medicamentos (por ejemplo, la dopamina) en el bloque de la aurícula izquierda utilizando una bomba de medicación estándar. NOTA: Tenemos medicamentos dosificados de acuerdo con la whole peso corporal del animal puesto que el flujo equivalente a un gasto cardíaco conjunto pasa a través del bloque de la fibrilación; sólo una pequeña porción de este pasa a través de la circulación coronaria, como lo hace en vivo. Alternativamente, un segundo conjunto de perfusión se puede crear con una concentración preestablecida de la medicación y se utiliza para perfundir el corazón. NOTA: En nuestro protocolo, se infunde medicamentos durante un período de 12 min, la recogida de datos fisiológicos durante la 10 min final de cada uno de infusión y comparándolo con un 10 min de línea de base inmediatamente anterior. 9. Las manipulaciones fisiológicas Ritmo cardiaco (Opcional) sutura de dos electrodos de estimulación en la pared de la aurícula derecha y se unen a un dispositivo de estimulación temporal. NOTA: Esto permite un control preciso de la frecuencia cardíaca (por encima de la frecuencia sinusal nativo) y una comprensión de la relación entre la frecuencia cardiaca y la contractilidad independiente de un medicamento cardiotónico. precarga variar laprecarga (definido como el volumen diastólico final del ventrículo izquierdo) mediante la variación de la altura de la columna de la alimentación del bloque de la aurícula izquierda. Presión sanguínea Manipular la presión de la sangre (el principal determinante de la poscarga en este modelo) usando las válvulas de presión en la IH-51. contenido de oxígeno coronaria Lograr diferentes grados de hipoxia miocárdica mediante perfusión del corazón con KaJaB saturada en diversas mezclas de gases. Para ello debe utilizar depósitos encamisados ​​separados (cada uno con su propia mezcla de gases) para asegurar el equilibrio entre el gas y KaJaB. Lograr la isquemia coronaria mediante sutura ligadura de una arteria coronaria distal. NOTA: La ligadura de las arterias coronarias proximales en el modo de trabajo del corazón puede dar lugar a disfunción miocárdica letal. Inducir la isquemia coronaria mundial al interrumpir o retrasar la perfusión retrógrada durante un período de tiempo definido.