El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos
Summary
There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.
Abstract
Los intestinos – que contienen el mayor número de células inmunes de cualquier órgano en el cuerpo – están constantemente expuestos a antígenos extraños, tanto microbiana y la dieta. Dada la comprensión creciente de que estos antígenos luminales ayudan a dar forma a la respuesta inmune y que la educación de las células inmunes en el intestino es crítica para un número de enfermedades sistémicas, se ha aumentado el interés en la caracterización del sistema inmunitario intestinal. Sin embargo, muchos protocolos publicados son arduo y que consume tiempo. Presentamos aquí un protocolo simplificado para el aislamiento de linfocitos de la propria del intestino delgado lámina, capa intraepitelial, y las placas de Peyer que es rápido, reproducible, y no requiere gradientes de Percoll laboriosas. Aunque el protocolo se centra en el intestino delgado, también es adecuado para el análisis de los dos puntos. Por otra parte, se destacan algunos aspectos que pueden necesitar una optimización adicional en función del ques científica específicación. Este enfoque da como resultado el aislamiento de un gran número de linfocitos viables que posteriormente se pueden utilizar para el análisis de citometría de flujo o medios alternativos de caracterización.
Introduction
La tarea principal del intestino delgado es a menudo considerada como la digestión y absorción de nutrientes 1. Si bien esta función metabólica es claramente esencial, el intestino delgado tiene un papel igualmente importante en la protección del huésped de la descarga continua de antígenos ambientales que se encuentran dentro de la luz 2. El tracto intestinal separa el mundo exterior (por ejemplo., Antígenos luminales) de el ambiente interno del huésped con una capa epitelial que es sólo una única capa de células de espesor. Como tal, el sistema inmunitario del intestino delgado tiene el formidable tarea de equilibrar su umbral para la reactividad, lo que permite antígenos extraños de la dieta y comensales microbios para entrar en la mucosa con un mínimo, en su caso, la respuesta inmune mientras que el montaje de una respuesta sólida contra la invasión de patógenos y otros antígenos "perjudiciales". Las respuestas inmunitarias excesivas o inapropiadas a estos antígenos pueden conducir a la enfermedad patológica (por ejemplo., Inflammaenfermedad toria del intestino, diabetes tipo I, esclerosis múltiple) y debe evitarse 3-6.
En general, se considera que el tracto gastrointestinal para representar el órgano más grande inmune en el cuerpo, que contiene más de 70% de todas las células 7 que secretan anticuerpo. El sistema inmunitario del intestino delgado se compone de 3 compartimentos principales – la lámina propia (LP), la capa intraepitelial, y parches de Peyer (PP) – que cada uno contiene un grupo distintivo de linfocitos 2. Los linfocitos LP (LPLS) son principalmente las células T TCRαβ con células ~ 20% de B; linfocitos intraepiteliales (IEL) contienen muy pocas células B con más células T que TCRγδ + células T TCRαβ; y PP, que son los órganos linfoides secundarios incrustados en la pared del intestino delgado, contienen células B ~ 80%. Aunque cada una de estas regiones anatómicas tiene funciones ligeramente distintas y bases ontológicas, que funcionará de ahmoda armonized para proteger al huésped de insultos patógenos.
Por otra parte, existe un creciente reconocimiento de que la microbiota es un determinante crítico para el desarrollo del sistema inmune intestinal, con un creciente reconocimiento de la relación entre los microbios específicos afines y la ontogenia de determinados linajes celulares 8,9. Además, dado que la educación del sistema inmunitario intestinal afecta a las respuestas inmunes en sitios anatómicamente distantes (por ejemplo., La artritis, la esclerosis múltiple, neumonía), se ha hecho evidente que el desarrollo del sistema inmunitario intestinal es relevante para más procesos de la enfermedad de reconocido previamente 10 -12. Como tal, el interés en evaluar cuantitativamente el sistema inmune intestinal ha extendido más allá de las interacciones huésped-patógeno para incluir ahora la interacción huésped-comensal y la patogénesis de muchas enfermedades sistémicas así.
Dada la variabilidad de los métodos actuales de laaislamiento de los linfocitos intestinales, un método que se ha optimizado para el rendimiento, la viabilidad, y la consistencia y equilibrar el tiempo requerido es cada vez más crítica. Protocolos que involucran gradientes de Percoll son el tiempo y mano de obra intensiva y potencialmente más propenso a un error humano, dando lugar a un rendimiento variable de 13 y viabilidad. En este documento, se proporciona un protocolo optimizado para el aislamiento y caracterización de linfocitos de los 3 compartimentos inmunes del intestino delgado. Además, dado el aumento de interés en alteraciones de microbios inducida en el sistema inmune de la mucosa, que incluye pasos que se pueden utilizar para permitir la transmisión horizontal de microorganismos entre los ratones para evaluar cómo estos cambios afectan cuantitativamente el sistema inmunitario intestinal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presenta un protocolo para el aislamiento y caracterización de citometría de los linfocitos del intestino delgado, incluyendo la LPL va a componer, y linfocitos en el PP de flujo. Para los interesados en la evaluación de cómo los cambios en la microbiota afectan el sistema inmunológico del intestino delgado, se detallan los pasos sencillos que intervienen en la transmisión horizontal de organismos entre los ratones que albergan diferentes microorganismos involucrados. Aunque este protocolo se centra en el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NKS is supported by NIH award K08 AI108690.
Materials
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| stir bar | VWR | 58949-062 | |
| multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 96-well plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (optional) fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
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